骨髓间充质干细胞在梗死心肌移植再生后nesprin蛋白表达的实验研究

　　　　作者：杨文钢， 薛松 汪铮， 连锋， 徐根兴 刘沙 黄日太， 朱洪生， 张谷兰

【摘要】 目的： 研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植到急性心肌梗死区心肌样细胞再生后nesprin蛋白的表达情况。方法: 大鼠16只，随机分为实验组和对照组，每组8只。利用密度梯度分离法和贴壁培养MSCs，流式细胞仪检测MSCs表面相关抗原、DAPI标记MSCs备用;SD大鼠开胸手术结扎心脏冠脉左前降支建立心肌梗死模型，并在实验组梗死区注射MSCs，对照组注射DMEM;术后3周取梗死区心肌，利用免疫细胞学化学方法鉴定肌节肌动蛋白和肌钙蛋白的表达，免疫荧光技术和蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白在MSCs移植后的表达。结果: MSCs移植到梗死缺血区3周后可以用DAPI示踪、并有心肌细胞特异蛋白呈阳性表达;免疫荧光和蛋白质印迹鉴定在MSCs移植前后有nesprin蛋白的表达，移植后出现nesprin蛋白表达量的增加。结论: MSCs在梗死心肌内移植具有分化再生的能力，nesprin蛋白在MSCs移植后出现表达量的增加，可能在MSCs分化为心肌细胞样过程中起到一定的作用。

【关键词】 nesprin蛋白; 间充质干细胞; 细胞移植; 心肌细胞再生

　　[Abstract] Objective: Identify the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells(MSCs)into myocardiumlike cells after MSCs was transplanted into acute myocardial infarction.Then， identify the expression of nesprin protein. Methods: Sixteen SD rats were randomly pided into experimental group (n=8) and the control group (n=8).MSCs were isolated and purified from the bone marrow of rats by density gradient centrifugation and adhering to the culture plastics. Surfaceassociated antigens of MSCs were detected by flow cytometry. These cells were labeled with DAPI. SD rats were anesthetized， through thoracotomy，then ligated the left anterior descending coronary artery in order to establish model of myocardial infarction. The DAPI marking MSCs were injected into the infarcted area in the experimental group; DMEM was used in the control group.The expression of αsarcomeric actin， troponin I were studied by immunocytochemistry three week later when MSCs were transplanted into acute myocardial infarction. The expression of nesprin protein in MSCs was identified by immunofluorescence and westernblotting before and after transplantation. Results: MSCs can be traced by DAPI three weeks later when MSCs were transplanted into the infarcted ischemic area. The expression of αsarcomeric actin and troponin I were positive in MSCs three weeks after transplanting into the infarcted ischemic area. The expression of nesprin protein was positive in MSCs by immunofluorescence and westernblot whenever MSCs were transplanted or not. But， three weeks after MSCs were transplanted，the expression of nesprin protein in the infarcted ischemic area was higher than that of DMEM was used in the infarcted ischemic area. Conclusion: This study suggests that MSCs were capable to differentiation with subsequent myocardial regeneration，after being implanted into the infarcted myocardium; the expression quantity of nesprin protein was higher after MSCs were implanted. When MSCs are differentiating into cardiac myocytelike， nesprin protein may play a role in this procession.

　　[Key words] nesprin protein; mesenchymal stem cells; cell transplantation; cardiomyocyte regeneration

　　Nesprin蛋白是一种细胞核膜蛋白质，在很多组织均有表达，其中以骨骼肌、心肌和血管平滑肌表达较高;研究发现其除了在细胞的有丝分裂、RNA的复制转运、细胞核膜的稳定性方面起着关键作用外，在细胞的分化中可能也起到相关的作用[1，2]。Nesprin蛋白的缺失将导致相关性疾病的发生，如扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)、埃德二氏肌营养不良(EmeryDreifuss muscular dystrophy，EDMD)等遗传性疾病，影响细胞骨架组织和动态平衡，将引起细胞骨架刚性的丧失，或者导致细胞的过早成熟老化[3]。Nesprin蛋白的研究对治疗一些以肌肉和心血管系统为表现的遗传疾病有重要意义。

　　心肌在缺血损失后表现为功能不全或者严重心功能衰竭，虽然药物和外科手术可以缓解病情，改善组织缺血，但无法改变取代受损的心肌细胞。通过移植骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)到缺血心肌组织可以分泌多种因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等改善心功能，代替受损心肌细胞[4，5]。我们建立大鼠急性心肌梗死模型，将体外分离提取、培养及4′，6二脒基2苯吲哚盐酸(DAPI)标记的MSCs经局部注射移植入梗死心肌区域内。观察MSCs在梗死心肌移植后的分化情况，同时对nesprin蛋白进行鉴定，为临床细胞移植治疗心脏疾病打下理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康SD大鼠16只，体质量250～300 g，由上海交通大学医学院动物实验中心提供。随机分为实验组和对照组，每组8只。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　LDMEM培养基、特级胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶和EDTA(Gibco公司);密度为1.077的Ficoll(GE公司);荧光标记抗鼠CD45FITC、抗鼠CD90PE(eBioscience公司);抗鼠CD29APC(BioLegend公司);抗鼠心肌特异性肌钙蛋白I(TnI)抗体、抗鼠肌节肌动蛋白、兔抗大鼠nesprin蛋白抗体(Abcam公司);Triton(Amresco公司);牛血清白蛋白BSA(Proliant公司);细胞分离液(Gibco公司);荧光标记山羊抗兔LgG(Abcam公司);Trizol(Invitrogen公司);BCA 试剂盒(碧云天公司)。倒置荧光相差显微镜(Olympus公司);FACSca流式细胞仪(Becton Dickinson公司);垂直电泳仪(GE公司);半干转膜仪、硝酸纤维素膜(BioRad公司);ECL发光剂(GE公司);柯达活体成像仪cymentre2000(Kodak 公司);无菌DAPI 储存液 (Sigma公司);动物小型呼吸机(浙江动物实验仪器厂)。

　　1.3 MSCs的分离和培养[6-8]

　　密度梯度离心贴壁培养法:引颈处死SD大鼠，75%乙醇浸泡，无菌条件下取股骨和胫骨，在无菌皿中，用LDMEM反复冲洗骨髓腔;利用密度梯度离心法分离MSCs。含LDMEM，20% FBS，100 U/ml氨苄西林的培养液悬浮获取细胞，调整细胞浓度为2×106/ml后，25 cm培养瓶、37 ℃ 5%CO2细胞培养箱培养。3～4 d后首次换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3天换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长满至瓶底面积的80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶常规消化，按1∶3比例传代培养。第2代的MSCs用来实验研究。

　　1.4 MSCs的特征性抗原的鉴定[8]

　　取第2代MSCs，细胞分离液消化，被测细胞浓度用含1%FBS的PBS缓冲液调节至1×106/ml，吸取50 μl标本，加入抗大鼠CD45FITC、CD90PE和CD29APC各10 μl，对照未加抗体;4 ℃暗环境孵育30 min。PBS洗2遍后加入0.5 ml PBS将细胞打匀，应用流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD45、CD90和CD29的表达情况。

　　1.5 DAPI标记细胞

　　第2代的MSCs 80%～90%融合时，移植细胞当天将无菌的DAPI储存液加入培养的MSCs培养液中，至终浓度为50 mg/L，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用PBS平衡盐溶液冲洗6遍以除去未结合的DAPI。离心收集细胞，用无血清的DMEM悬浮，移植所需细胞数为3×106，置于冰上备用。

　　1.6 动物模型的建立及细胞的注射

　　通过结扎冠脉左前降支建立急性心肌梗死模型。将动物注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后固定在手术台上，用笔型静脉置留针进行气管插管接呼吸机(呼吸频率85次/min;呼吸比1∶1;潮气量18 ml)，胸部剃毛、乙醇棉球消毒，在左胸3～4肋间逐层进胸，在左心耳与肺动脉圆锥下1～2 ml左右找血管，穿70号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下范围的心肌有发白，手术完成关胸。梗死模型以组织病理学验证。心肌梗死1周后注射MSCs，使用30 G针头、1 ml注射器把用DAPI标记的细胞0.3 ml(3×106个细胞)分3点注射到心肌梗死区内，对照组使用等量未含细胞的DMEM。

　　1.7 心肌梗死的病理学检测

　　模型成功后将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，分别用刀片将心脏切成1 mm厚的切片，放入0.1%的2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，37 ℃水浴7～10 min，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。苏木精伊红(HE)染色按步骤进行。

　　1.8 组织免疫荧光化学检测

　　3周后处死动物，取出心脏，取梗死区组织进行冰冻切片(8 μm/张)，在荧光镜下观察到有DAPI标记的细胞存在，并进行相应部位免疫荧光染色检测肌节肌动蛋白和nesprin蛋白的表达。将冰冻切片放入4 ℃酮内固定10 min，晾干后，用0.01 mol/L，pH7.4的PBS冲洗切片3×3 min，再用0.1% Tritonx100处理15 min PBS漂洗切片，使切片保持一定湿度。0.03%过氧化氢/甲醇封闭内源性过氧化物酶20 min(25 ℃;1% BSA室温孵育30 min 后加入各种蛋白抗体4 ℃过夜;第2天，加荧光标记二抗，25 ℃孵育60 min;PBS漂洗3×5 min;取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。立即用荧光显微镜观察(实验过程避光操作)。观察标本的特异性荧光为阳性反应。对照组取相同部位梗死组织，操作均同，以供对照。

　　1.9 蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白的表达情况

　　收集MSCs组和DMEM组心肌梗死区组织检测nesprin蛋白，提取蛋白， BCA 法测定蛋白质含量。参照分子克隆实验指南进行纯化蛋白的SDSPAGE。SDSPAGE电泳、转膜、封闭后加入1∶1 500稀释的抗neprin多抗(用TBST稀释)，4 ℃反应过夜。加入羊抗兔IgGHRP (TBST稀释 1∶5 000)，室温作用2 h，TBST漂洗，加入ECL显色液，置于柯达活体成像仪中观察结果，条件设置为曝光5 min，CCD自动获取图片结果。相应蛋白表达值为条带的灰度值除以β肌动蛋白(1∶1 000， 43 ku)内参照校正。

　　1.10 统计方法

　　使用Image Programer软件对图片进行分析，利用GraphPad Prism 5 Demo和SAS v6.12软件进行相关统计学分析，所得数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，实验进行3次。

　　2 结 果

　　2.1 MSCs培养和细胞的特性鉴定

　　培养24 h后约80%左右贴壁，贴壁细胞中见少许逗点状或短棒状细胞。3天后，贴壁细胞呈短梭形、多角形，细胞呈扁平多角不规则形态。7～10 天左右细胞间排列渐紧密、呈均匀一致的长梭形，并有克隆集落形成、渐融合，贴满瓶底，原代培养结束。流式细胞仪分析MSCs表面抗原CD29和CD90阳性，CD45阴性(图1)。

　　2.2 DAPI标记细胞效果情况

　　DAPI标记的细胞1 h染色效果较强，3周后效果明显减弱，可能是出现荧光衰减(图2)。

　　2.3 TTC和HE染色结果

　　TTC染色示非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色;HE染色示心肌梗死区心壁明显较正常心壁变薄(图3)。

　　2.4 免疫荧光检测结果

　　DAPI标记3周后在荧光显微镜下仍可见，移植3周的MSCs荧光染色表现出肌节肌动蛋白和肌钙蛋白阳性结果，移植心肌梗死区MSCs检测到有nesprin蛋白的阳性表达，对照组未见明显的相应表达(图4)。

　　2.5 蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白的表达

　　结果显示，MSCs组nesprin蛋白表达量高于DMEM组，差异有统计学意义(P&<0.05)。见图5。

　　3 讨 论

　　MSCs可以使用Ficoll密度梯度分离法和贴壁培养法得到有效的分离和扩增，MSCs可以在体外扩增和诱导最终分化成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞、肌细胞和心肌细胞等。MSCs具有较好的可塑性和活力，我们课题组前期研究表明骨髓单个核细胞移植可以提高心肌缺血模型的心功能，但单个核细胞至少包含了造血干细胞、间充质干细胞和内皮组细胞等;曾用Brdu标记MSCs移植到心肌缺血模型，3周后检测到MSCs表达MHCs、肌钙蛋白等心肌特异性收缩蛋白和缝隙连接蛋白43，同时产生连接效应，与相关学者报告一致[4，5]。在本实验中我们再次进行DAPI标记的MSCs移植，DAPI对细胞无明显毒性作用。实验3周后在荧光镜下仍能看到DAPI标记的MSCs。使用荧光免疫学和蛋白质印迹技术检测到3周后移植到体内缺血区的MSCs表达肌钙蛋白和肌节肌动蛋白。进一步说明了MSCs在体内有分化为心肌样细胞的能力，但什么原因引起MSCs分化和MSCs分化的机制并不明确，为此我们对MSCs分化前后的另一蛋白——nesprin蛋白进行了检测和对比，以提出此蛋白可能在MSCs分化中起到一定的作用。

　　细胞分化中基因表达的调节控制是一个十分复杂的过程，在蛋白质合成的各个水平，从mRNA的转录、加工到翻译，都会有调控的机制。在DNA水平也存在调控机制(如基因的丢失、放大、移位重组、修饰以及染色质结构的变化等)。相关研究发现:在细胞有丝分裂间期nesprin1和2与核膜附近异染色质存在表位连接[1，2]。nesprin1直接与伊默菌素结合，但由于蛋白核膜位点结合区的退化而不能和自整合障碍因子(barriertoautointegration factor，BAF)相结合，BAF蛋白质与dsDNA的连接牵涉到染色质的重塑和转录过程[9]。体外共沉淀实验证明nesprin1和2蛋白的钙调蛋白同源区域和肌动蛋白连接，在细胞迁移过程中调整组织细胞骨架肌动蛋白起到了作用[2， 3]。在骨骼肌肌节内，不同的nesprin1和2存在Z带、A/I接头、肌质网和线粒体膜上，肌节蛋白如钙离子通道受体(ryanodine受体)和mAKAP与nesprins相结合[10]，有关研究表明nesprin1α为肌细胞A激酶定位蛋白(muscle Akinase anchoring protein，mAKAP)在心肌细胞核膜上的受体，而由mAKAP及相关成分组成的复合体在心肌细胞内具有传导cAMP和钙离子信号的作用[10]。研究证实了在肌肉形成过程中，有nesprin蛋白各亚型量的增加或者减少，说明nesprin蛋白在肌细胞中起到了关键的调节作用;nesprin1基因突变导致了人和小鼠心脏疾病的发生，说明nesprin蛋白的缺失将引起细胞的异常增殖、异常分化和个体器官的异常发育[11]。

　　本实验中利用蛋白质印迹检测到nesprin蛋白在移植MSCs心梗组织的表达量高于未移植MSCs的心梗组织。有关研究提示nesprin是肌细胞分化过程中复杂结构的重排和重组所必需，这在肌肉兴奋/收缩过程中，对保证肌细胞内细胞器正确的空间定位以确保钙信号正常传递非常重要。体外实验:C2C12肌细胞分化成肌管，nesprins从细胞核及核膜转移到细胞质和肌节，表明nesprins在肌肉的分化中起到特殊的作用。但其如何引起细胞的分化还不清楚。本实验发现nesprins在MSCs移植后出现表达的增加，可能在分化中起到了作用。肌节肌动蛋白是横纹肌肌动蛋白，仅存在于骨骼肌和心肌，是肌细胞舒缩活动的物质基础。肌钙蛋白是心肌细胞中的调节蛋白，由钙离子参与调节、控制收缩蛋白的舒缩活动。正因为多种蛋白都与钙离子的参与和调节相关、且对细胞骨架的维持和信号传递相关，以后的研究考虑是否能够以钙离子作为切入点寻找一条信号通道对MSCs分化成心肌细胞的机制进行相关研究。

　　(本文图2～图4见彩色插图)

参考文献

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