散发性乳腺浸润性导管癌患者BRCA1、BRCA2基因的表达及临床意义

【摘要】 目的： 研究散发性乳腺浸润性导管癌患者乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)、乳腺癌易感基因2的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法: 采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法对95例乳腺浸润性导管癌、28例乳腺腺病患者的BRCA1、BRCA2基因进行检测，并从病理科资料中提取患者的肿瘤大小、淋巴结转移情况以及雌激素受体(estrogen receptor，ER)、人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor2，HER2)的表达结果，分析BRCA1、BRCA2基因水平和患者的肿瘤大小、淋巴结转移情况及ER、HER2表达的关系。结果: BRCA 1、BRCA 2基因在癌组织的阳性率分别为50.5%(48/95)、52.6%(50/95)，癌旁组织阳性率66.3%(63/95)、72.6%(69/95)，乳腺腺病组织阳性率89.3%(25/28)、92.9%(26/28)。癌组织与癌旁组织、乳腺腺病组织比较，BRCA1、BRCA 2基因的阳性率均下降，差异均有统计学意义(P&<0.05)。BRCA1、BRCA 2的阳性率与淋巴结转移呈负相关(r值分别为-0.228，-0.223，P&<0.05)，与ER的表达均呈负相关(r值分别为-0.37，-0.289，P&<0.05)，与HER2的表达均呈负相关(r值分别为-0.282，-0.498，P&<0.05)，与肿瘤大小无明显相关性(P&>0.05)。结论: 乳腺上皮中BRCA1和BRCA2基因对乳腺癌的发生、发展具有一定的作用，检测此两种基因的表达可协助筛查出乳腺癌高危患者及早期发现乳腺癌。BRCA1和BRCA2基因亦可作为评价乳腺癌生物学特性和预后的潜在指标。

【关键词】 乳腺癌易感基因; 雌激素受体; 乳腺浸润性导管癌; 乳腺腺病

　　[Abstract] Objective: To investigate the level of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1) and BRCA2 in sporadic invasive ductal carcinoma and to analyze its relationship with other clinicopathologic parameters. Methods: RTPCR was used to detect the level of gene BRCA1 and BRCA2 in 95 cases of sporadic invasive ductal carcinoma tissue samples and 28 adenosis tissue samples. The clinicopathologic parameters including tumor size， axillary nodal status， estrogen receptor and HER2 expression were obtained from pathological documents.The level of BRCA1/BRCA2 was compared between the sporadic invasive ductal carcinoma tissues and adenosis tissues. In sporadic invasive ductal carcinoma， the correlation between BRCA1/BRCA2 and other clinicopathologic parameters mentioned above was further analyzed. Results: The positive rates of BRCA1 gene were 50.5%(48/95)in breast cancer tissues and 89.3%(25/28)in adenosis tissues， while in breast cancer adjacent tissues， the rates were 66.3%(63/95).The positive rates of BRCA2 gene were 52.6%(50/95)in breast cancer tissues and 92.9%(26/28)in adenosis tissues， while in breast cancer adjacent tissues， the rates were 72.6%(69/95). The positive rates of BRCA1 and BRCA2 were lower in breast cancer tissues than in cancer adjacent tissues and adenosis tissues，with a significant difference(P&<0.05). The gene BRCA1/BRCA2 was negatively correlated with lymph node metastasis， and negatively correlated with the expression of estrogen receptor and HER2 expression(P&<0.05). No correlation was found between BRCA1/BRCA2 and tumor size(P&>0.05). Conclusion: The gene BRCA1/BRCA2 in breast epithelium may play an important role in the development of breast carcinoma. To detect them helps to choose patients at high risk of developing breast carcinoma and achieve early diagnosis. The gene BRCA1/BRCA2 may be a potential marker for estimating the biological behavior and prognosis of breast cancer.

　　[Key words] breast cancer susceptibility gene; estrogen receptor; invasive ductal carcinoma; adenosis

　　乳腺癌是指发生于乳腺导管或乳腺小叶上皮细胞的恶性肿瘤，占女性全部恶性肿瘤的22%，在欧美发达国家甚至高达26%[1]，其中浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)是临床最常见的病理类型。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)和乳腺癌易感基因2(BRCA2)是迄今发现的与乳腺癌发生有关的易感基因。乳腺癌以遗传性和散发性两种形式存在，遗传性乳腺癌约占5%～10%，这些遗传性乳腺癌中的21%～40%与BRCA1、 BRCA2基因突变有关[2]。但BRCA1和BRCA2与非遗传性、散发性乳腺癌相关性的报道较少[3]。我们检测了散发性浸润性导管癌、癌旁组织及腺病组织中BRCA1、BRCA2基因的阳性率，比较BRCA1、BRCA2基因在三者之间的差异，并对散发性浸润性导管癌中BRCA1、BRCA2基因与临床相关病理特征之间的关系进行了分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 临床资料及标本 收集江苏大学附属人民医院2008年5月到2009年5月经病理证实的乳腺浸润性导管癌患者手术切除标本95例及乳腺腺病患者手术切除标本28例，所有乳腺癌病例无一级或二级亲属患乳腺癌，患者年龄42～75岁，平均54岁;乳腺腺病患者年龄35～64岁，平均49岁。所有标本术后0.5～1 h迅速-70 ℃冻存备用。

　　1.1.2 主要试剂与仪器 Trizol(Invitrogen公司)，RTPCR试剂盒(Fermentas公司)，PCR仪(7300型，美国ABI公司)，凝胶成像仪(英国Gene公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 RNA的提取 采用Trizol一步法快速提取组织总RNA，通过紫外分光光度法测定D(260 nm)与D(280) nm，计算RNA的浓度和纯度;取D(260 nm)/D(280 nm)1.8至2.0之间的样本。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

　　1.2.2 逆转录反应 反应体系为50 μl。RNA 2 μl，DEPC水8 μl，随机六聚寡核苷酸引物(0.05 μg/μl) 4 μl，共14 μl，65 ℃ 5 min，取出后冰上放置5 min，再加入下列体系:DEPC水 20.5 μl，5×RT 缓冲液10 μl， dNTPs 2.5 μl， 逆转录酶MMLV 2.0 μl，RNasin 1.0 μl，反应条件为42 ℃ 60 min，-20 ℃保存。

　　1.2.3 聚合酶链反应(PCR) 反应体系为25 μl，包括10×缓冲液2.5 μl， MgCl2 2.0 μl，dNTP 0.5 μl，Taq酶(1 U/μl) 1 μl， h3O16 μl，cDNA 1 μl， 引物1 1 μl，引物2 1 μl。BRCA1上游引物:5′GATTTGACGGAAACATCTTAC3′，下游引物:5′CCAGCATCAGTAGTATGA3′;反应条件为94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30个循环后72 ℃延伸10 min。BRCA2上游引物:5′GTTGTGAAAAAAACAGGACTTG3′，下游引物:5′CAGTCTTTAGTTGGGGTGGA3′。反应条件为94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56.9 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30个循环后72 ℃延伸10 min。β肌动蛋白上游引物:5′CTCGCGCTACTCTCTCTTTC3′，下游引物:5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′。以看家基因β肌动蛋白为内参照进行质控和标化。每个PCR反应均重复3次。扩增产物在含0.5 mg/L溴乙啶的2.0%琼脂糖凝胶中电泳分离，于凝胶成像仪上扫描分析条带。BRCA1/2表达水平的相对值=BRCA1/2 D值/β肌动蛋白D值。

　　2 结 果

　　2.1 BRCA1基因在乳腺癌、癌旁及乳腺腺病组织中的检出情况

　　经RTPCR 分析发现，乳腺癌组织中BRCA1 mRNA 的相对水平为0.415 3±0.155 6，而在乳腺癌旁及乳腺腺病组织中其表达水平分别为1.112 7±0.233 3 和1.007 4±0.193 1，后两者明显高于前者(图1)。

　　BRCA1基因在乳腺癌、癌旁组织及乳腺腺病组织中的阳性表达率分别为50.5%(48/95)、66.3%(63/95)、89.3%(25/28)。经χ2检验分析得出，在乳腺癌、癌旁组织及乳腺腺病组织中BRCA1阳性率呈递增趋势，具有相关性(χ2=14.953， P=0.001&<0.005)。与乳腺腺病比较，BRCA1在乳腺癌及癌旁组织中的阳性率皆明显下降(χ2=13.466， P&<0.001， χ2=5.605， P=0.018&<0.05)。BRCA1在乳腺癌和癌旁组织中的阳性率间差异亦有统计学意义(χ2=4.875，P=0.027&<0.05)。

　　2.2 BRCA2基因在乳腺癌、癌旁及腺病组织中的检出情况

　　经RTPCR 分析发现，乳腺癌组织中BRCA2 mRNA 的相对水平为0.296 6 ±0.233 4，而在乳腺癌旁及乳腺腺病组织中其表达水平分别为0.759 7±0.122 8 和0.665 1 ±0.221 4，后两者明显高于前者。见图2。

　　BRCA2基因在乳腺癌、癌旁组织及乳腺腺病组织中的阳性表达率分别为52.6%(50/95)、72.6%(69/95)、92.9%(26/28)。经χ2检验分析得出， 在乳腺癌、癌旁组织及乳腺腺病组织中BRCA2阳性表达呈递增趋势，具有相关性(χ2=18.540， P&<0.001)。与乳腺腺病相比，BRCA2在乳腺癌及癌旁组织中的阳性率皆明显下降，具有相关性(χ2=14.821， P&<0.001， χ2=5.032， P=0.025&<0.05)。BRCA2在乳腺癌和癌旁组织中的阳性率差异亦有统计学意义(χ2=8.118， P=0.004&<0.05)。

　　2.3 BRCA1基因与IDC临床病理的关系

　　经多个样本的χ2检验，无淋巴结转移，转移1～3个淋巴结，4～10个淋巴结组之间差异有统计学意义(P=0.026&<0.05)，经Spearman相关分析提示BRCA1基因与淋巴结转移呈负相关(r=-0.228，P=0.026&<0.05)，BRCA1基因在雌激素受体(estrogen receptor，ER)，人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor2，HER2)阴性组的检出率均高于ER，HER2阳性组，且差异有统计学意义(P1=0.039&<0.05，P2=0.006&<0.05)，经Spearman相关分析提示BRCA1基因的检出与ER呈负相关(r=-0.37，P&<0.001)，与HER2呈负相关(r=-0.282， P=0.006&<0.05)，BRCA1基因的检出与肿瘤大小无关(P=0.082&>0.05，表1)。

　　2.4 BRCA2基因与IDC临床病理的关系

　　经多个样本的χ2检验，无淋巴结转移，转移1～3个淋巴结，4～10个淋巴结组之间差异有统计学意义(P=0.021&<0.05)。经Spearman相关分析提示BRCA2基因与淋巴结转移呈负相关(r=-0.223，P=0.030&<0.05);BRCA2基因在ER，HER2阴性组的检出率均高于ER，HER2阳性组，且差异均有统计学意义(P1=0.005&<0.05，P2 &<0.001)，经Spearman相关分析提示BRCA2基因的检出与ER呈负相关(r=-0.289，P=0.004&<0.05)， 与HER2呈负相关(r=-0.498，P&<0.001)，BRCA2基因的检出与肿瘤大小无关(P=0.183&>0.05)。见表1。

　　3 讨 论

　　BRCA1基因是一种人乳腺癌易感基因，于1990年被Hall等发现，具体定位于染色体17q21D17s1321～D17s1325之间，是由22个编码外显子和2个非编码外显子构成，全长约100 kb[4]。该基因作为一种抑癌基因，在抑制细胞生长、细胞周期调控、基因转录调节、DNA损伤修复及凋亡等重要细胞活动以及维持基因稳定性中起重要作用[5]。BRCA1基因突变可导致这些功能的抑制或削弱。野生型BRCA1诱导凋亡并抑制雌激素依赖型转录通路，该通路与乳腺上皮细胞增生有关，基因突变后抑制作用减弱而致癌[6]。Yang等[7]观察了175例日本散发性乳腺癌患者，其中有60例(34.3%)BRCA1表1 BRCA1、BRCA2基因与临床病理特征之间的关系HER2阳性582434阴性3726110.0061939316&<0.001表达显著减少和缺失，经4.4年的随访，发现BRCA1阴性患者较阳性患者无瘤生存率明显降低(分别为7%和35%)。本组结果显示，BRCA1基因在乳腺腺病组织、癌旁组织及乳腺癌组织中的检出率明显降低。BRCA1主要通过E2F转录因子的作用以及CDKs复合物的磷酸化作用而参与细胞周期调控，抑制细胞进入增殖周期，阻止分裂，诱发细胞凋亡。BRCA1表达减少，对细胞分裂的抑制作用减弱，细胞在多种因素的作用下可最终发生癌变。

　　Marcus等[8]发现，与正常上皮细胞相比较，散发性乳腺癌癌细胞中BRCA1表达减少，而且BRCA1的减少与组织的潜在高恶性，包括低分化和腋窝淋巴结转移有显著联系。我们的研究发现，在乳腺癌中最常见的病理类型浸润性导管癌中，随着淋巴结转移数目的增多，BRCA1基因的检出率减少，且差异具有统计学意义。但BRCA1基因的检出与肿瘤大小无关。BRCA1基因的阳性率在ER阴性、HER2阴性的乳腺浸润性导管癌明显高于阳性组，表现为BRCA1基因与ER、HER2阴性表达相关联。乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤， ER、HER2表达情况已成为乳腺癌的重要预后因子，针对ER的内分泌治疗及针对HER2的分子靶向治疗已成为提高乳腺癌术后远期生存率的重要手段，研究者们亦发现野生型BRCA1可以显著抑制孕激素受体的活性[9]。另有报道发现[10]，BRCA1与ERα不但相互影响，还可共同协同作用调节下游基因(如VEGF)。而HER2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，也对细胞的增殖和分化起调节作用[11]， HER2通过抑制凋亡，上调血管内皮生长因子和血管通透性因子，促进肿瘤新生血管形成，增加肿瘤细胞的侵袭力[12]。但BRCA1与HER2之间可能的调节机制尚不清楚。本实验结果初步显示，BRCA1基因可通过某种途径影响ER和HER2的表达，但具体机制仍需进一步探讨。

　　BRCA2基因是继BRCA1后发现的第二个乳腺癌易感基因，基因序列与BRCA1无明显关联[13]，定位于13q12-13，可转录7.3 kb mRNA，编码3 418个氨基酸残基的长肽链，较易发生基因突变，导致其编码的蛋白质生物特性的丢失[14]，其突变可增加早期乳腺癌的发病率。目前BRCA2基因的确切作用机制还不十分清楚[15]，但有报道[16]其通过Rad51能与断裂的DNA相结合，通过同源同组的过程进行双链修复，此过程亦可能与p53基因的突变有着较大关系[17]。如果BRCA2修复功能丧失，则有可能会引起染色体的变化，进而可诱发癌症的发生。本组结果显示，BRCA2基因在乳腺腺病组织、癌旁组织及乳腺癌组织中的检出率明显降低，具有相关性。本实验结果也从侧面证明了BRCA2基因在乳腺癌的发生、发展过程中起着一定的作用。尽管BRCA2基因的作用机制未明确，但通过对其的检测仍可以早期发现一些肿瘤，如宫颈癌、胃癌、前列腺癌等[18]，为这些肿瘤的治疗争取时间。本实验同时还提示，BRCA2基因与淋巴结转移数目呈负相关，推断该基因在对乳腺癌的预后上起着一定的判断作用，但该基因与肿瘤大小无明显关联。BRCA2基因在乳腺癌的发生发展中具有重要作用，也可能与癌基因HER2有协同作用[19]。但本实验中发现BRCA2基因的检出与HER2呈负相关，可能与HER2阳性表达者恶性程度较高，侵袭能力强有关。实验结果也提示BRCA2基因的检出与ER呈负相关，但具体影响机制尚不清楚。尽管BRCA2抑癌作用的具体机制及途径尚未明了，对有关BRCA2基因及其在临床上应用的认识不多，但其对乳腺癌乃至其他肿瘤发生的意义，必将受到广泛重视。

　　BRCA1和BRCA2都是乳腺癌易感基因，在肿瘤发生中的作用及其调节机制还不十分清楚。但早期测定BRCA1与BRCA2基因可协助筛查高危乳腺癌患者，并可望为散发性乳腺癌的早期诊断、预后判断及治疗方案选择提供重要的依据。

参考文献

　[1] Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Estimating the world cancer burden:Globocan 2000[J].Int J Cancer，2001，94(2):153-156.

　　[2] King MC，Marks JH，Mandell JB，et al.Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2[J].Science，2003，302(5645):643-646.

　　[3] 王 曦，杨明添，曾益新.乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的突变检测及其临床意义[J].国外医学:肿瘤学分册，2001，28(1):63-64.

　　[4] Kennedy RD，Quinn JE，Mullan PB，et al.The role of BRCA1 in cellular response to chemotherapy[J].J Natl Cancer Inst，2004，96(22):1659-1668.

　　[5] 周纪东，郑婵颖，李永泉.乳腺癌与卵巢癌易感基因BRCA1和BRCA2[J].细胞生物学杂志，2002，24(1):11-14.

　　[6] 王玉林，赵荣宇，张丽芝. BRCA1和BRCA2在乳腺疾病中的表达和意义[J].中国医师进修杂志，2005，28(5):13-15.

　　[7] Yang Q，Sakurai T，Mori I，et al.Prognostic significance of BRCA1 expression in Japanese sporadic breast carcinomas[J].Cancer，2001，92(1):54-60.

　　[8] Marcus JN，Watson P，Page DL，et al.Hereditary breast cancer: pathobiology，prognosis，and BRCA1 and BRCA2 gene linkage[J].Cancer，1996，77(4):697-709.

　　[9] Ma Y，Katiyar P，Jones LP，et al.The breast cancer susceptibility gene BRCA1 regulates progesterone receptor signaling in mammary epithelial cells[J].Mol Endocrinol，2006，20(1):14-34.

　　[10] Kawai H，Li H，Chun P，et al.Direct interaction between BRCA1 and the estrogen receptor regulates vascular endothelial growth factor(VEGF)transcription and secretion in breast cancer cells[J].Oncogene，2002，21(50):7730-7739.

　　[11] 朱孝峰，周军民，谢冰芬，等.HER/neu受体酪氨酸激酶抑制剂SUCI02对乳腺癌细胞周期的影响及其分子机理[J].中国肿瘤临床，2004，31(22):1261-1264.

　　[12] Powell WC，Hicks DG，Prescott N，et al.A new rabbitmonoclonal antibody (4B5) for the immunohistochemical (IHC) determination of the HER2 status in breast cancer:comparison with CB11，fluorescence in situ hybridization (FISH) and interlaboratory reproducibility[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15(1):94-102.

　　[13] Wooster R，Bignel G，Lancaster J，et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2[J]. Nature，1995，378(6559):789-792.

　　[14] Tavtigian SV，Simard J，Rommens J，et al. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13qlinked kindreds[J]. Nat Genet，1996，12(3):333-337.

　　[15] Alison W. New insights into the biological function of BRCA2 from its stuctural interactions[J]. Breast Cancer Res，2003，5(2):107-108.

　　[16] Wilson JH，Elledge SJ. BRCA2 enters the frag[J]. Science，2002，297(5588):1822-1823.

　　[17] Gretarsdottir S，Thoriacius S，Valgrdsdottir R， et al. BRCA1 and P53 mutations in primary breast cancer in relation to genetic instability[J]. Science Res，1998，58(5):859-862.

　　[18] Grimmond SM， Palmer JM， Walters MK， et al. Confirmation of a susceptibility locus on chromosome1 3 in Australian breast cancer families[J]. Hum Genet，1996，98(1):80-85.

　　[19] Phillips KA. Immunophenotypic and pathologic differences between BRCA1 and BRCA2 hereditary breast cancers[J].J Clin Oncol， 2000， 18(21 suppl): 107-112.