小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

作者：肖德乾，肖欢，胡国艳，那志萍，郑淑华，刘伟，张良清，徐军发

【摘要】 目的 探讨小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法 采用特异性引物扩增小鼠B7H4（mB7H4）胞外功能区DNA，经酶切、拼接构建原核表达载体pET28amB7H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21 (DE3)菌株，采用IPTG诱导表达、NiNTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDSPAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实了构建的pET28amB7H4重组表达载体含有mB7H4编码序列，其序列分析与GenBank中公布序列对比一致，质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为26.5 KD的目的蛋白，SDSPAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16，ELISA法检测抗体效价为1∶12 800，Western blot分析显示抗体能特异性结合mB7H4。结论 成功制备了高表达重组mB7H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7H4多克隆抗体，为进一步研究B7H4的功能奠定了基础。

【关键词】 B7H4；原核表达载体；基因表达；多克隆抗体
　　
　　Abstract: Objective To study the construction and expression of a prokaryotic expression vector for murine B7H4 and preparation of a polyclonal antibody.Methods Murine B7H4 (mB7H4)gene was amplified with specific primers. The PCR product was digested with enzymes and then ligated to reconstruct recombinant prokaryotic expression vector pET28amB7H4 that expresses the mouse B7H4 and 6 His fusion protein. The expression vector was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced with IPTG to express mB7H4 fusion protein that was then purified with NiNTA Purification System and analyzed with SDSPAGE. The purified fusion protein was used to prepare polyclonal antibody with rabbit.Results The sequence analysis confirmed that this recombinant expression vector contained mB7H4 coding sequence that was identical with the published sequence in GenBank. The plasmid expressed a 26.5kD protein. After purified with NiNTA Purification System， the resulted protein was analytically pure according to the analysis with SDSPAGE. The titer of the antiserum were 1∶16 and 1∶12800 detected by double diffusion test and ELISA， respectively. Western blot analysis demonstrated that the antimB7H4 antibody bound specifically to mB7H4.Conclusion The prokaryotic expression vector and the antiserum for mB7H4 were prepared successfully， which established a foundation for the further study of B7H4.
　　
　　Key words: B7H4; prokaryotic expression vector; gene expression; polyclonal antiserum
　　
　　B7H4（B7x，B7S1）是T细胞活化的共抑制分子（coinhibitor），其mRNA广泛表达于淋巴样和非淋巴样组织（如肺、睾丸、胰腺、前列腺），但其蛋白质在各种组织中不表达或低表达，而在树突状细胞（DC）、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞表面诱导性表达［14］。跨膜型B7H4和可溶性B7H4Ig融合蛋白均可抑制T细胞活化［15］，提示B7H4可能在维持机体自身耐受方面起重要作用。目前，国内对B7H4基因原核表达的研究相对较少，我们在克隆了小鼠B7H4（mB7H4）基因的基础上［6］构建表达mB7H4His融合蛋白的原核表达载体pET28amB7H4，并制备兔抗mB7H4多克隆抗体，为进一步研究B7H4的生物学功能奠定了基础。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 动物、质粒和菌株
　　
　　大肠杆菌DH5a和BL21 (DE3)均为本实验室保存。pGEMTmB7H4载体由本实验室构建［6］，pET28a(+)表达载体购于Novagen公司。成年新西兰家兔（2kg/只）由广东医学院实验动物中心提供。

　　1.2 试剂
　　
　　质粒抽提和胶回收试剂盒购自Invitrogen（上海）公司，限制性内切酶购于NEB公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，Taq酶购于TaKaRa生物工程公司，DNA Marker和蛋白质Marker购于天根生化科技有限公司，镍离子金属螯合柱(NiNTA)购自Invitrogen（美国）公司，HRP标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术公司，PVDF膜为美国PALL公司产品。DNA合成和测序由Invitrogen（上海）公司完成。常规试剂为国产分析纯。
　　
　　1.3 载体构建
　　
　　采用PCR技术，自pGEMTmB7H4载体中扩增除mB7H4的胞外段，引物序列为Sense：5'GTT TTC CCA TGG GCA TTT CAG GCA AGC ACT TC3'，Antisense：5' GTT TTC CTC GAG GGA GTT CAG CAA CTG CAG CTG3'，在引物的5'端分别插入NcoI和XhoI限制性内切酶位点，PCR产物长度为699 bp。酶切并回收mB7H4 PCR产物，同时采用NcoI和XhoI酶切pET28a(+)载体，并将mB7H4连接到pET28a(+)载体中，构建pETmB7H4表达载体，该载体表达mB7H4His融合蛋白，分子量为26.5kD，经酶切和序列测定鉴定pETmB7H4。
　　
　　1.4 重组蛋白的表达
　　
　　将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转化入感受态E.coli BL21 (DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含Kana的LB平板上，筛选表达菌。挑取pETmB7H4转化的单个菌落并接种入100 mL LB培养基中，于37℃摇菌过夜。取出菌液后，按1∶100接种于含有Kana的LB培养基中，于30℃摇菌培养至A600=0.6，取1 mL菌液（未诱导）离心取菌体沉淀置-20℃冻存。同时在剩余菌液中加入1 mol/L IPTG至终浓度为1 mmol/L，于30℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达，并于1、2、4、6 和8h各取1 mL菌液做SDSPAGE鉴定mB7H4蛋白的表达。
　　
　　1.5 重组蛋白的制备和鉴定
　　
　　在30℃诱导表达4h的条件下，将诱导后的菌液于4℃、8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用PBS(pH 7.4)洗涤3次，然后加入裂解缓冲液(20 mmol/L PBS、500 mmol/L NaCl、pH 7.8)和溶菌酶(1.0 g/L)，冰浴30 min，超声破碎菌体，于4℃、13 000 r/min离心20 min，分别收集上清和沉淀，并用8.0 mol/L尿素溶解沉淀，用镍离子金属螯合柱(NiNTA)纯化目的蛋白(按Invitrogen公司提供的操作说明进行)，收集洗脱液。
　　
　　1.6 兔抗mB7H4血清的制备和效价测定
　　
　　用PBS缓冲液对纯化的mB7H4进行透析除盐，离心取上清，过滤除菌后，调整蛋白质量浓度为1.0 g/L，与等体积弗氏完全佐剂乳化，选择3只健康新西兰白兔进行免疫。每周免疫1次，共免疫4次，免疫途径分别为足跖、月国窝淋巴结、背部皮内多点注射和背部皮下多点注射。免疫剂量为0.5 mg/（次·只）。末次免疫后第10天，经颈总动脉放血、分离血清。采用双向琼脂扩散试验和间接ELISA方法鉴定抗血清的效价，用Protein AAgarose亲和层析纯化IgG。
　　 　　
　　1.7 兔抗mB7H4血清特异性鉴定
　　
　　取纯化的重组mB7H4，同时取经IPTG诱导后的含pET28a(+)空载体或pETmB7H4表达载体的BL21菌各1.0 mL，离心沉淀取菌体，溶于100 μL水中，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，于100℃水浴煮沸5 min，进行SDSPAGE，电泳后电转至PVDF膜上，用含脱脂奶粉的PBS(50 g/L)封闭，以制备的抗血清为一抗（1∶2 000），羊抗兔IgGHRP（1∶2 000）为二抗进行Western blot杂交，以DAB显色。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 pETmB7H4载体的构建和鉴定
　　
　　扩增片断的大小同预期的结果一致，pETmB7H4载体酶切后释放的片断为699 bp，详见图1。序列测定结果表明，mB7H4胞外功能区基因与GenBank中登录的小鼠B7H4 cDNA的序列（NM_178594）完全一致。
　　
　　1:Nco I单酶切pETmB7H4;2:Nco I、XhoI双酶切pETmB7H4; M: DNA marker
　　
　　图1 重组表达载体构建及鉴定（略）
　　
　　2.2 重组蛋白的表达和纯化
　　
　　SDSPAGE分析显示，菌液未经IPTG诱导时未检测到有重组蛋白的表达，而经1 mmol/L IPTG诱导1、2、4、6、8h后，重组蛋白的表达持续增高，其分子量大小约为26.5 kD，与预期融合蛋白分子量的大小一致，详见图2。纯化后mB7H4的纯度达到电泳纯，详见图3。
　　
　　1：未经IPTG诱导含pETmB7H4的BL21(DE3)菌体蛋白；2～6：经1mmol/L IPTG诱导1、2、4、6和8h的含pETmB7H4的BL21(DE3)菌体蛋白；M：蛋白Marker
　　
　　图2 SDSPAGE分析不同诱导时间mB7H4的表达（略）
　　
　　1： 纯化的mB7H4重组蛋白； 2： 经1mmol/L IPTG诱导的含pETmB7H4的BL21(DE3)菌体蛋白；M： 蛋白Marker
　　 　　
　　图3 SDSPAGE分析纯化的mB7H4重组蛋白（略）
　　
　　2.3 兔抗mB7H4血清的效价和特异性鉴定
　　
　　双向琼脂扩散试验检测制备的兔抗mB7H4的效价为1∶16，间接ELISA法鉴定抗血清效价为1∶12 800。Western blot检测结果显示诱导表达菌蛋白及纯化蛋白均在约26.5kD处出现了特异蛋白条带，而在未加诱导剂的菌体蛋白中未见有反应条带，说明所制备的抗mB7H4多抗可与所表达的目的蛋白结合，并且特异性较好，详见图4。

　　1：未经诱导的含pETmB7H4的BL21(DE3)菌体蛋白；2：经1mmol/L IPTG诱导的含pETmB7H4的BL21(DE3)菌体蛋白；3：纯化的mB7H4重组蛋白；M： 蛋白Marker
　　
　　图4 Western blot鉴定抗体的特异性（略）

　　3 讨论
　　
　　人B7H4的cDNA全长约1.8kb，位于人染色体1p11.1，在基因组上跨越66kb，含有6个外显子和5个内含子［13］。序列分析表明，B7H4的开放读码框(ORF) 部分由849个碱基对组成，编码一个具有282个氨基酸的蛋白。B7H4 蛋白由信号肽区、一对VC 免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞浆区组成［13］。小鼠B7H4位于小鼠3号染色体上有6个编码区［14］，在蛋白结构上与人B7H4同源性高达87%。目前发现多种肿瘤细胞表达B7H4，尤其在卵巢癌［812］、乳腺癌［1213］、肺癌［14］和肾癌［15］组织中B7H4的表达较高。有研究认为B7H4可能与肿瘤细胞逃逸机体免疫攻击密切相关，因此B7H4可能是肿瘤生物治疗的有效靶点，构建B7H4原核表达载体并制备抗血清对进一步研究B7H4的生物学功能以及B7H4与肿瘤免疫逃逸的关系具有重要意义。
　　
　　为了更好地研究mB7H4胞外功能区的生物学功能、制备针对抗mB7H4胞外功能区抗体，我们根据B7H4胞质区仅含有两个氨基酸残基的结构特征［13］在构建pETmB7H4载体时去掉了mB7H4基因N末端的信号肽序列、跨膜区和膜内区。我们对蛋白表达条件也进行了优选，尝试在不同诱导时间和不同温度等条件下诱导蛋白表达，结果发现即使在25℃条件下mB7H4仍主要以包涵体形式表达，因此我们选择1.0 mmol/L IPTG在30℃时诱导表达4h作为表达条件提取包涵体，再通过变性、复性制备mB7H4。本实验采用以T7 lac为启动子的pET28a(+)原核表达载体，目的基因得到高效表达，表达的目的蛋白带有组氨酸标签，应用镍柱与组氨酸亲和特性获得了较为满意的纯化效果。将纯化蛋白复性后免疫家兔，采集兔血清并进行纯化，通过双向琼脂扩散法和间接ELISA法检测制备的抗血清效价分别达到了1∶16和1∶12 800，效价较高。Western blot分析检测表明抗体能特异性结合mB7H4。本实验为进一步研究B7H4蛋白的功能及其与恶性肿瘤等免疫性疾病的关系奠定了基础。

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