IGFBP3、caspase3在小鼠白念珠菌阴道炎模型黏膜组织中的表达

　　　　 作者：陈嵘，樊翌明，林映萍，黎兆军，吴志华

【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）、半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)在ICR小鼠白念珠菌阴道炎模型中阴道黏膜局部的表达及其临床意义。方法 构建ICR小鼠白念珠菌阴道炎模型，运用荧光实时定量PCR及免疫组化检测感染组与正常组中IGFBP3、caspase3表达的差异。结果 构建ICR小鼠白念珠菌阴道炎模型成功，感染组阴道组织中见大量念珠菌丝及炎症细胞浸润；IGFBP3、caspase3在感染组中较正常组高表达（Ｐ&<0.01）且两者表达呈正相关(rs=0.683，Ｐ&<0.01)。结论 IGFBP3、caspase3在感染组中高表达可能与念珠菌下调阴道黏膜免疫并致病有关。

【关键词】 caspase3；IGFBP3；白念珠菌；动物模型
　　
　　Abstract:Objective To investigate the expression of insulinlike growth factorbinding protein3 (IGFBP3) and caspase3 in murine vaginal mucosa with experimental candidiasis.Methods The ICR murine vaginal mucosa was infected with Candida albicans to establish candidiasis model. The level of IGFBP3 and caspase3 in murine vaginal mucosa from the candidiasis group and the normal control group were determined by realtime quantitative fluorescent PCR and immunohistochemistry， respectively.Results In the candidiasis group， the vaginal mucosa was seen with a great deal of monilia mycelia and inflammatory cells. The expression of IGFBP3 and caspase3 were higher in the candidiasis group than those in the control group (Ｐ&<0.01)， with a positive correlations between the expression of IGFBP3 and caspase3 (rs=0.683，Ｐ&<0.01).Conclusion The candidiasis model is successfully constructed. The overexpression of IGFBP3 and caspase3 in the experimental candidiasis may play a role in the pathogenesis of candidal vaginitis through reducing the immunity of the vaginal mucosa.
　　
　　Key words：caspase3；IGFBP3；Candida albicans；murine model
　　
　　念珠菌性阴道炎(monilial vaginitis) 绝大部分感染由白念珠菌引起，是一种常见的阴道黏膜真菌感染性疾病。表现为外阴瘙痒和阴道分泌物增多、阴道疼痛、灼热，可通过性接触传染。约75％育龄妇女在一生中至少发生一次念珠菌性阴道炎，其中约半数病例有再次发作，5%病例发展为复发性念珠菌性阴道炎［1］ 。此病的免疫学发病机制尚未阐明，最近研究发现:外周血中产生的细胞免疫可能并不是小鼠阴道黏膜主要的防御机制，而更多的是通过局部细胞免疫发挥机体的防御机制，因此黏膜免疫已成为该病研究热点［2］。有研究表明胰岛素生长因子（IGFⅠ）不仅在机体生长发育中充当重要角色，而且可激活体内淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞对免疫调节及抑制凋亡起重要作用。胰岛素生长因子结合蛋白3（IGFBP3）是一种新发现的分泌蛋白，它在组织中广泛存在，并可结合IGFⅠ进而对免疫起调控作用［3］。但IGFBP3、caspase3及其IGFIGFBP轴在念珠菌阴道炎中的表达及分子调控途径尚未清楚。因此，有必要对上述细胞因子在小鼠白念珠菌阴道炎模型中阴道黏膜免疫的作用进行深入研究，进而阐明念珠菌性阴道炎的发病机制，为本病的有效防治提供理论依据。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 念珠菌的培养及实验动物
　　
　　菌株为标准白念珠菌(No. 00270)株，实验动物为健康清洁级雌性ICR 小鼠30只，饲料为标准颗粒饲料（均由广东学院实验动物中心提供）。鼠龄9～11 周，体质量(26 ±4)g，随机分为感染组（A组，15只）及正常对照组（B组，15只），饲养于清洁级实验动物环境。培养基为改良沙堡琼脂培养基平皿。真菌悬液的制备: 参照文献［4］，将标准菌株接种于含1 %蛋白胨和0.1 %葡萄糖的液基中，25℃水浴振荡培养16～18 h (见图1a)。显微镜下计数，使菌悬液密度为5×106个孢子/mL 。
　　
　　1.2 ICR小鼠白念珠阴道炎模型的建立
　　
　　A组为雌激素化组，每只ICR小鼠在接种前6d开始后腿皮下注射含有0.1 mg 苯甲酸雌二醇油剂0.1mL ，每2d注射1次。B组于相同部位注射植物油0.1mL，次数同A组。将真菌悬液10μL(即白念珠菌孢子接种量为5 ×104个) 在接种日注入A组小鼠的阴道内，每只小鼠接种后倒置5min，B组用生理盐水代替。接种后的第2、4、7、14 天为检测日，每个检测日在A组选取5只，B组选取5只小鼠，麻醉后，用生理盐水湿润的阴道拭子在A、B组小鼠阴道组织分别取阴道分泌物涂片，并实施手术将各小鼠阴道组织取下，分两份［4］。一份石蜡包埋待HE染色、PAS染色及免疫组化检测，另一份提取总RNA逆转录为cDNA后再进行荧光定量PCR检测。
　　
　　1.3 免疫组化检测
　　
　　石蜡标本4μL切片，经常规脱蜡至水，灭活过氧化物酶，抗原水浴修复后。严格按Caspase3（1:20 R&&D systems U.S.A MAB835）及免疫组化AEC染色试剂盒（R&&D systems U.S.A CTS018）说明书进行，设阳性对照及空白对照。结果判断:以胞浆染色（或）胞核着色为阳性，并按着色强弱分级：无着色为0，浅棕红色为1，深棕红为2。着色范围以计数阳性细胞所占的百分比均值：&<5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51～75%为3，&>75%为4。上述两项相加为Caspase3表达强度积分：1为阴性，2为弱阳性（+），3、4为阳性（），&>4为强阳性（）［5］。采用OLYMPUS的BX51显微系统及DP71图像采集系统进行观测结果并拍照。
　　
　　1.4 实时荧光定量PCR检测
　　
　　用Trizol溶液（(Invitrogen， San Diego， CA， U.S.A.)提取小鼠阴道组织总RNA，逆转录为cDNA，再进行实时荧光定量PCR检测。根据GeneBank序列设计IGFBP3、βactin引物，序列见表1。荧光PCR仪为（MX 3000P 美国stratagene），反应条件同文献。应用SYBR GreenⅠ荧光染料（美国Biotium公司）技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值。
　　
　　1.5 统计学处理
　　
　　采用SPSS13.0统计软件进行处理，数据以（±ｓ）表示，用MannWhitney秩和检验及Spearman相关分析进行统计描述和多样本均数组间比较，以Ｐ&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　表1 引物序列（略）

　　注：F，上游;R，下游。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 ICR小鼠念珠菌模型构建结果
　　
　　A组小鼠真菌接种2 d后阴道出现白色分泌物，第4、7天分泌物增多，并出现外阴红肿，14 d后小鼠阴道口红肿明显，出现黄白色豆渣样分泌物。而B组小鼠无明显阴道分泌物及外阴红肿。A组用无菌阴道拭子取阴道分泌物涂片，见芽生孢子及菌丝，第4、7天菌丝密集并成团，可见较多淋巴细胞、多形核巨噬细胞、上皮细胞等，B组无孢子及菌丝，可见少量上皮细胞。上述结果表明成功构建小鼠念珠菌模型。
　　
　　2.2 PAS染色及免疫组化结果
　　
　　阴道石蜡包埋标本切片用PAS染色后可见A组阴道黏膜组织或其外有菌丝附着，侵入以第7天最为明显，后逐渐减少，并持续到观察期末。阴道黏膜及其下可见炎性浸润细胞(见图1a)红色箭头为念珠菌菌丝。B组无菌丝及明显炎性细胞浸润(见图1b)。小鼠阴道组织免疫组化caspase3检测发现A组caspase3表达明显高于B组（Z=3.904，Ｐ&<0.001），AEC显色示caspase3阳性呈棕红色主要位于上皮细胞及炎性细胞胞浆，但部分细胞可出现胞浆、胞核染色，B组无明显caspase3阳性细胞（见图1c、d)。
　　
　　2.3 荧光PCR结果
　　
　　应用RTPCR法，以βactin为内参，分别对A组和B组在小鼠念珠菌阴道炎模型第7天阴道组织提取的IGFBP3mRNA进行定量检测，获取各组标本的标准曲线，计算机分析ΔCt值。SPSS13.0软件对数据进行统计学描述。结果显示A组在白念珠菌感染后IGFBP3mRNA的含量均升高；B组变化不明显（见图2）。A组Ct值(15.937±4.740)，B组Ct值(9.426±1.537)，但方差不齐，采用秩和检验(Z=4.726，Ｐ&<0.001)两组比较差异具有统计学意义，A组IGFBP3mRNA表达量高于B组，见图2。采用Spearman相关分析示IGFBP3表达与caspase3表达呈正相关性，rs=0.683。
　　
　　（a）A组小鼠第7天阴道组织切片，红色箭头所示为PAS阳性的念珠菌菌丝，（PAS染色 ×200）；（b）B组小鼠阴道组织切片无PAS阳性的念珠菌菌丝（PAS染色 ×200）；（c）A组阴道组织第7天免疫组化caspase3检测，caspase3阳性呈棕红色主要位于上皮细胞及炎性细胞胞浆，呈强阳性（AEC染色 ×200）红色箭头为阳性表达细胞；（d）B组第7天免疫组化caspase3检测，无明显caspase3阳性细胞（AEC染色 ×200）。
　　
　　图1 A、B两组阴道组织切片及免疫组化caspase-3检测（略）
　　
　　RealtimePCR示A组IGFBP3mRNA在白念珠菌感染7 d后，其表达量明显高于B组。
　　
　　图2 A、B两组IGFBP-3mRNA表达量（略）

　　3 讨论
　　
　　IGFBP3是胰岛素样生长因子结合蛋白超家族( IGFBPs) 中一名新成员。用小鼠IGFBP3的cDNA作探针，从人的肝细胞cDNA文库中筛选到人的IGFBP3的cDNA序列，全长1920bp，基因定位于11A1［6］。IGFBP3与其他结合蛋白有高度同源性，它能与胰岛素样生长因子(IGFs) 相结合，携带、转运IGF，延长IGF的半衰期，调控IGF的生物活性；更为重要的是，IGFBP3具有许多不依赖于IGF的生物作用。IGFBP3在多种组织细胞的生长发育、免疫调节、凋亡、癌变及黏膜组织炎症等病理生理过程中起重要作用［3］。研究发现在许多单核细胞、淋巴细胞、NK细胞表面存在IGFI受体，表明IGFI可对免疫起调节作用，如IGFI可作为IL7的辅助因子促进B细胞增殖，Th1型细胞因子如IFNγ、TNFα增强IGFⅠ的表达，并激活T细胞免疫功能。抗原刺激亦可使IGFI上调，从而引起机体的特异性免疫［78］。上述研究提示IGFI可增强免疫防御功能，而IGFBP3可与IGFI高亲和力结合从而起免疫抑制作用。阴道黏膜含有大量上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，上述细胞是阴道的黏膜免疫重要组成成份，而在念珠菌性阴道炎的发病与黏膜免疫的抑制及阴道微环境改变有关。但IGFBP3在黏膜免疫中的作用及念珠菌性阴道炎的致病机制尚未明确，因此本课题构建了小鼠念珠菌性阴道炎感染模型，对上述问题进行探讨。
　　
　　根据阴道涂片及阴道组织PAS染色，我们发现A组（感染组）小鼠阴道分泌物涂片可见大量芽生孢子菌丝，阴道上皮细胞及淋巴细胞、多形核细胞，阴道组织见念珠菌菌丝侵入。B组未发现芽生孢子及菌丝，表明小鼠念珠菌性阴道炎感染模型构建成功。荧光PCR结果A组IGFBP3mRNA的表达明显较B组升高(Ｐ&<0.01)， 提示IGFBP3表达上调可能与念珠菌性阴道炎的发病有密切关系。IGFBP3在肿瘤中主要起促凋亡作用，是机体抵抗肿瘤的自身保护因素。那么IGFBP3在念珠菌性阴道炎中上调在其发病中的意义何在呢？于是我们采用免疫组化检测A、B两组间促凋亡关键蛋白caspase3表达的差异。本研究发现caspase3在感染组（A组）中高表达，阳性表达主要位于上皮细胞及炎性细胞胞浆（见图1c、d），而caspase3的表达与IGFBP3呈正相关（rs=0.683，Ｐ&<0.01）。因此我们认为IGFBP3在念珠菌感染时表达上调可引起上皮细胞及树突状细胞、巨噬细胞和T细胞等阴道的黏膜免疫重要组成成份细胞凋亡，黏膜免疫抑制导致了念珠菌性阴道炎的发病。蒋洪敏等［9］研究指出白念珠菌菌血症能诱导小鼠胸腺细胞凋亡，而且呈时间和剂量依赖性而白念菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡有赖于真菌的代谢，热灭活的白念珠菌不能诱导胸腺细胞凋亡。上述证据支持了念珠菌感染可诱导免疫细胞凋亡，但念珠菌代谢抗原如何引起IGFBP3的表达上调进而导致T免疫细胞凋亡还需进一步研究。而IGFBP3的促凋亡作用有研究表明是通过非IGF结合途径引起，如促进SMARCB1合成导致BNIP3L（BCL2家族的促凋亡蛋白）升高引起caspase3激活所致［10］。另外IGFBP3与IGFⅠ结合抑制其免疫增强功能也参与了念珠菌性阴道炎的发病。其次最近的研究表明，IGFBP3除了与IGF结合外，还是一种重要的胰岛素结合因子，它与胰岛素以高亲和力相结合（是IGFBP3与IGF结合力的500倍），从而阻断胰岛素与其受体间的结合，阻止后者自身磷酸化及其它后续反应的发生，从而参与糖代谢功能的紊乱和II型糖尿病的发生，而糖尿病是念珠菌感染的易发因素，因而IGFBP3高表达亦可能是促进念珠菌感染的间接因素之一。
　　
　　总之，IGFBP3在念珠菌性阴道炎中高表达，其可能通过促进黏膜免疫相关细胞的凋亡，使T细胞减少，宿主免疫由Th1 型转化为Th3 型［4］；以及增加念珠菌易感性等因素来参与念珠菌性阴道炎的发病，但具体致病机制还需进一步深入研究。
　　

参考文献

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