木犀草素体内抗炎作用机制研究

　　　　　　 作者：张毅，王旭光，杨展，何惠娟

【摘要】 目的 探讨木犀草素(Lut)的体内抗炎疗效及作用机制。方法 采用角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型，观察Lut对足爪肿胀度的影响；酶免疫测定法( EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫组织化学法(IHC)及免疫印迹(Western blot)法检测角叉菜胶致炎大鼠足爪组织环氧合酶2（COX2）的表达情况。结果 Lut可抑制角叉菜胶致炎的大鼠足爪肿胀。80、120 mg/kg Lut可显著降低足爪炎症组织前列腺素E2（PGE2）生成，并显著抑制炎足爪中COX2的蛋白表达。结论 Lut具有较强的抗炎作用，其机制可能与抑制COX2的表达及PGE2的释放有关。

【关键词】 木犀草素；环氧合酶2；炎症；前列腺素E2
　　
　　Abstract: Objective To investigate the antiinflammatory effect and mechanism of luteolin invivo. Methods The model of carrageenaninduced edema of rat hind paws was prepared. The edema model was treated with luteolin and dexamethasone (for a positive control). The PGE2 content in the edema exudate was measured by EIA. The COX2 expression of the edema paws was detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Luteolin reduced the paw edema， the PGE2 contents in the exudate and the COX2 protein expression in the edema paws. Conclusion Luteolin has an antiinflammatory effect on rat inflammation induced by carrageenan probably through the mechanisms of the inhibition of COX2 protein expression and of PGE2 production.
　　
　　Key words: luteolin; cyclooxygenase2; inflammation；prostaglandin E2
　　
　　木犀草素(Luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用［12］。我们研究发现Lut在体外能抑制环氧合酶2(COX2) mRNA及蛋白表达，同时降低NFκB的DNA结合活性和蛋白表达［3］，其抗炎机制可能与此有关。为进一步探讨Lut的抗炎作用机制，我们建立大鼠足爪肿胀炎症模型，研究Lut对炎症大鼠 COX2 表达及前列腺素E2（PGE2）生成的影响。

1 材料和方法

　　1.1 材料

　　清洁级雄性SD大鼠，体质量150～250 g，由广东医学院实验动物中心提供。角叉菜胶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为美国Sigma 公司产品；Lut（纯度&>98%）和PGE2 EIA Kit为美国Cayman公司产品；βactin山羊IgG多克隆抗体、COX2山羊IgG多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒均为北京中山公司产品；PVDF膜为美国Pall Gelman公司产品。

　　1. 2 方法

　　1.2.1 大鼠分组

　　50只大鼠随机分为5组，分别为空白对照组、2mg/kg地塞米松(Dex)阳性对照组及40、80、120mg/kg Lut 3个剂量组，每组10只。实验时分别腹腔注射等体积生理盐水、地塞米松及40、80、160mg/kg剂量的Lut。

　　1.2.2 大鼠足爪肿胀测定

　　腹腔注射给药30 min后于大鼠右后足跖皮下注射1% 角叉菜胶0.1mL/只致炎，分别在致炎前，致炎后0.5、1、2、3、4、5 h用大鼠足爪容积测定仪测量炎足爪容积，计算各组大鼠不同时间点足爪肿胀度。

　　肿胀度(mL)=致炎后右后足容积－致炎前右后足容积。

　　1.2.3 大鼠足爪炎性渗出物中PGE2含量的测定

　　大鼠右后足致炎5 h后处死大鼠，于大鼠右踝关节处剪下足爪，称重剥皮浸泡于5 mL 生理盐水中浸泡30 min，取出足爪，离心浸泡液15 min(3000×g)，取上清液0.5 mL，以PGE2 EIA Kit测定其中的PGE2含量(μg/g)，并计算抑制率。

　　抑制率IR(%)=对照组PGE2含量-给药组PGE2含量对照组PGE2含量×100%

　　1.2.3 Western blot

　　取足跖致炎组织约20 mg加入0.2 mL细胞裂解液在匀浆器中匀浆后，将裂解液于冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4℃，12 000g离心10 min， 收集上清液，考马斯亮蓝（G250）染色法测上清液蛋白质含量。每组各取50 μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10%SDS PAGE；电转移至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBS(PH8.0)封闭2 h；分别加入适量COX2和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2 h；洗膜3次每次20 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2 h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan 5.0进行光密度积分值分析，计算目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。

　　1.2.4 免疫组织化学（IHC）

　　取足跖部位的组织，用10%中性缓冲福尔马林及时固定，石蜡包埋，切片，贴片，常规脱蜡。0.1mol/L PBS(pH 7.4)浸泡5 min。微波修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液(试剂B)，室温20 min。滴加1:50稀释的COX2羊IgG单克隆抗体，阴性对照以PBS代替一抗，于4℃孵育过夜。PBS洗3次。滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂C)，室温孵育10 min， PBS冲洗3次。滴加试剂SABC(试剂D)，37℃，30 min，PBS冲洗3次。DAB显色。苏木素轻度复染。脱水，透明，中性胶封片。显微镜观察。结果判断：以胞浆出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，光学显微镜下观察，每组随机计数500个细胞，计算阳性表达率。同时观察染色强度，按染色强度着色淡黄为弱阳性（+），棕黄为阳性（），棕褐为强阳性（），无着色为阴性（－）。

　　1.2.5 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计软件进行分析，行单因素方差分析及Dunnett's检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

　　2. 1 Lut对角叉菜胶诱导大鼠足爪肿胀的影响

　　结果表明，40 mg/kg Lut组在0.5、1、2、3、4、5 h各时间点所测得的足爪肿胀度与空白对照组相比较，差异均无统计学意义（P&>0.05）；在0.5、1 h时80、120 mg/kg Lut组与空白对照组相比较，足爪肿胀度也无明显差异；从2h开始，80、120 mg/kg Lut组及地塞米松组的大鼠足爪肿胀度均明显小于空白对照组 (P&<0.01)。见表1。表1 Lut对角叉菜胶诱导大鼠足爪肿胀的影响（略）

　　2.2 Lut对足爪大鼠炎性渗出物中PGE2的影响

　　结果如表2所示，与空白对照组相比较，40 mg/kg Lut组的PGE2含量差异无统计学意义（P&>0.05）。而80、120 mg/kg Lut组及地塞米松组都能明显降低大鼠足爪炎性渗出物PGE2的含量，与空白对照组相比较，差异有统计学意义（P&<0.01）。

　　2.3 Western blot检测Lut对大鼠足爪中COX2蛋白表达的影响
　　
　　Western blot结果及图像分析结果显示，40mg/kg Lut组与空白对照组相比较，COX2的蛋白表达量无明显差异，而80、120 mg/kg Lut组与地塞米松组COX2的蛋白表达量均明显下降。见图1、表3。表3 各组COX2／βactin蛋白表达量的光密度积分值比值（略)

　　2.4 免疫组化检测Lut对大鼠足爪中COX2蛋白表达的影响
　　
　　结果如图2所示，COX2蛋白表达阳性部位主要在在细胞浆中，在高倍镜下可见胞浆内棕黄色染色小颗粒。N为PBS代替一抗的阴性对照，细胞浆内未见阳性染色区域，而空白对照组与40mg/kgLut组阳性染色细胞明显，COX2蛋白表达阳性，两组阳性表达率相比较差异无统计学意义。80、120mg/kg Lut组及地塞米松组阳性染色细胞百分数减少，其阳性表达率与空白对照组相比较明显下调（P&<0.01），见表2。

　　3 讨论

　　角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀为急性非特异性的炎症模型，主要表现为局部的充血、水肿及渗出等病理反应过程。研究表明角叉菜胶所致的肿胀是由组胺、5羟色胺、激肽和PGE2几种炎症介质相继作用的结果，组胺及5羟色胺主要控制1.5h内的肿胀，激肽则与1.5～2.5h的肿胀有关，PGE2则是2.5h后肿胀的主导。我们实验的结果表明，80、120 mg/kg Lut组及地塞米松组抑制大鼠足爪肿胀的作用呈现一定的时间特点，在1h内均不能缓解角叉菜胶致炎引起的足爪肿胀，而从2　h开始，抑制足爪肿胀的作用就表现得很明显。这结果表明Lut的抗炎作用可能与PGE2关系密切。随后角叉菜胶致大鼠足爪炎性渗出物PGE2含量测定表明，Lut组炎性渗出物中PGE2含量均明显下降。而COX2蛋白表达检测结果显示，80、120mg/kgLut及地塞米松腹腔给药后，均显著抑制了大鼠足跖部位COX2的蛋白表达。结果表明Lut的抗炎作用与抑制炎症组织COX2的表达从而减少PGE2的释放有关。

　　研究表明Lut抗炎作用与多种炎症因子相关，近期研究认为其抗炎的机制主要在于：抑制细胞因子IL4、IL6的产生；通过抑制信号传导过程来抑制 NFkappaB介导的基因表达；抑制炎症介质的释放，如白三烯、组胺、前列腺素等；抑制上皮细胞内ICAM 1的表达；促进INFγ的分泌［4］。Hougee 等［5］指出，Lut可体外剂量依赖地抑制脂多糖(LPS)刺激的人外周血单个核细胞促炎性因子TNFα、IL1β、IL 6的产生。Tormakangas 等［6］研究发现Lut可以抑制肺组织的炎症反应，其抗炎机制可能为通过抑制 NF κB 的磷酸化而使某些促炎性因子的产生减少。Gutierrez等［7］研究表明木犀草剂量依赖地显著减少NO合成和可诱生性一氧化氮合酶(iNOS)表达。PGE2作为一种强有力的炎症介质，体外研究表明Lut可以通过抑制COX2下调PGE2的生物合成［8］。我们实验表明Lut可在体内抑制炎症组织的COX2表达从而下调PGE2的生成，这可能是其抗炎的作用机制之一。

参考文献

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　　［3］张毅， 王旭光. 木犀草素的体外抗炎机制研究［J］. 广州中医药大学学报， 2007， 24(3): 231234.

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　　［6］Tormakangas L， Vuorela P， Saario E， et al. In vivo treatment of acute chlamydiap neumoniae infection with the flavonoids quercetin and luteolin and an alkyl gallate，octylgallate， in a mouse model［J］. Biochem Pharmacol， 2005，70(8): 12221230.

　　［7］Gutierrez V G， Kawasaki C P， Arroyo C， et al. Luteolin inhibits lipopolysaccharide actions on human gingival fibroblasts［J］.Eur J Pharmacol， 2006，541(12):95105.

　　［8］王旭光，陈根殷，陈妙萍.木犀草素对LPS诱导的RAW264.7细胞COX2 及mPGES1表达的影响［J］. 中药材，2007， 30(10)：12631266.