作者：陈玲玲，邬于川，刘玉林
【摘要】 目的 观察IFN-γ是否能诱导健康人外周血和脐带血中B细胞分泌产生抗体，以及两者产生抗体的差异，初探IFN-γ是否通过影响CD5+B1细胞的功能而诱发自身免疫性疾病，为进一步阐明IFN-γ诱发自身免疫性疾病的机制、研究自身免疫性疾病的临床防治提供实验依据。方法 无菌采集健康人外周血、脐带血，RosetteSepTM法分离得到B细胞，流式细胞仪检测B细胞纯度，将分离得到的外周血B细胞和脐带血B细胞分别经IFN-γ刺激，于培养的第3、5、7d ELISA法检测抗体的含量变化，对照组为未加任何刺激的外周血B细胞组和脐带血B细胞组。运用SAS统计软件将所得抗体的浓度进行统计学分析。结果 经流式细胞仪检测，B细胞纯度为81.4%，两种来源B细胞经IFN-γ刺激后，于第3d开始产生IgM。但是，在同一时间段，外周血与脐带血来源B细胞经培养后所产生IgM的量的差异均无统计学意义(P&>0.05);在血液来源相同的情况下随着时间的延长产生IgM的量逐步增加，三个时间段产生IgM的量进行两两比较的差异有统计学意义(P&<0.01);所有实验组均未检测到IgG，空白对照组未检测到IgM、IgG。结论 IFN-γ可刺激B细胞分泌产生抗体，且对B细胞的种类没有选择性;只刺激产生IgM，而无IgG产生，但其产生的抗体IgM的性质有待于进一步确定，其可能通过III型超敏反应机制诱导自身免疫疾病的发生。
【关键词】 IFN-γ;CD5+B1细胞;自身免疫性疾病;IgM
ABSTRACT Objective To make a preliminary study on the possibility of IFN-γin inducing the B cells in peripheral blood and cord blood to secret antibodies and the difference between the two kinds of antibodies， and to explore the possibility of IFN-γin inducing autoimmune diseases by its impact on the function of CD5+B1 cells so as to provide experimental basis for further elucidation of the mechanism of IFN-γ in inducing autoimmune diseases and the prevention and treatment of autoimmune diseases in clinic. Methods The peripheral blood and the cord blood of the healthy were collected under sterile condition and B cells were isolated from them with the method of RosetteSep TM and the purity of B cells was detected by flow cytometry; the secreted B cells from peripheral blood and from cord blood were respectively stimulated by IFN-γand the changes of antibody content on the third， the fifth and the seventh day after culture were detected with ELISA; no stimulations were added to the B cells of peripheral blood and cord blood in the control; the SAS statistical software was applied in the statistical analysis of the antibody concentration. Results The concentration of B cells detected by flow cytometry was 81.4%， the B cells from both bloods started excreting IgM on the third day after IFN-γstimulation; there existed no difference of statistical significance between the IgM content excreted by B cells in peripheral blood after culture and that in cord blood at the same time point (P&>0.05) while the IgM content from each of the bloods kept increasing with the time going; the multiple comparision of the IgM contents at the three time points showed out a difference of statistical significance (P&<0.01); no IgG was detected in the experimental groups and no IgM nor IgG was detected in the control. Conclusions IFN-γmay stimulate the B cells to secret antibodies， only IgM but no IgG， with no selection of the types of B cells while the properties of the secreted IgM needs further study， it may induce the occurrence of autoimmune diseases through type III hypersensitivity mechanism.
KEYWORDS IFN-γ CD5+B1 cells autoimmune diseases IgM
目前各种自身免疫性疾病的发病率不断升高，且逐步年轻化，这使人类的生命安全受到严重威胁。大多数自身免疫性疾病的治疗效果不理想，原因之一在于对这些疾病的发病机制和过程不很清楚。许多学者将自身免疫性疾病分为T细胞介导的、自身抗体介导的及联合介导的自身免疫性疾病三种[1-3]，其中CD5+B1细胞激活后的重要产物-自身抗体已作为诊断自身免疫性疾病的标志物，细胞因子的检测也在一定程度反映了自身免疫性疾病的发生、发展情况。但众多的研究表明[4-5]，细胞因子在自身免疫性疾病中的作用是多方面的，这体现在不同的细胞因子参与不同的自身免疫性疾病过程，同一种细胞因子在不同的自身免疫性疾病中作用也不尽相同。近年来，国内外学者已对细胞因子和CD5+B1细胞与常见自身免疫性疾病的关系进行了广泛研究，在某些自身免疫性疾病中发现CD5+B1细胞异常增生、IFN-γ水平发生改变。这说明，进一步明确自身免疫性疾病的发生发展与IFN-γ、CD5+B1细胞的关系对临床自身免疫性疾病的防治具有重要意义。
本实验运用ELISA技术分别检测健康人外周血和脐带血来源的B细胞经过IFN-γ刺激后产生抗体含量的变化，从而获得IFN-γ对健康人体内CD5+B1细胞抗体产生影响的依据，初步阐明IFN-γ能否通过影响CD5+B1细胞的功能而诱发自身免疫性疾病，为进一步探讨IFN-γ、CD5+B1细胞在自身免疫性疾病发病机制中的关联作用提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料 人脐带血，取自健康产妇;人外周静脉血，取自健康自愿者。RosetteSepTM/人B细胞(StemCell公司);人重组IFN-γ(Sigma);兔抗人IgG、IgM ELISA试剂盒(R&&D System，美国);鼠抗人CD19单克隆抗体(Bechman Coulter，美国);淋巴细胞分离液(Ficol1)(上海试剂二厂)。CO2培养箱(美国SHEL.LAB M-1815TC型);无菌超净工作台(上海净化设备厂);流式细胞仪(Epics XL，美国Bechman Coulter公司);全自动酶标仪(BIO-RAD 450型，美国);倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS Ch3BIMF200);离心机(LD-2A，北京医用离心机厂);96孔细胞培养板(Ciphergen Biosystems，USA orange公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 B细胞的分离纯化 无菌采集新生儿脐带血或人外周静脉血40 ml，EDTA抗凝，加入RosetteSepTM试剂2 ml，室温孵育20 min，加入等体积的PBS(含20 ml/L FBS)稀释，温和混合，铺加Ficoll液，室温下1200g离心20 min，取出位于Ficoll和血浆层之间的富集细胞层，用含20 ml/L FBS的PBS清洗细胞.收集细胞悬液，将收集到的细胞悬液置于小玻璃平皿中，37℃静置30min以去除单核细胞，收集上清即为B细胞悬液。流式细胞术(FCM)检测细胞纯度，记数板计数，用1640培养液调至约1.5×106 个细胞/ml待用。
1.2.2 刺激细胞及抗体检测 将外周血B细胞和脐带血B细胞(约1.5×106 个细胞)培养于96孔培养板，分别用IFN-γ(100u/ml)刺激培养，并设未刺激组为空白对照组，于培养后第3，5，7d收集培养上清液，ELISA法检测培养上清中的IgG、IgM含量。
1.2.3 数据采集与统计学分析 各组数据均以均数±标准差(±s)表示，采用SAS统计软件进行统计学分析。采用重复测量资料的方差分析，各组间的两两比较用Least significant difference法(LSD法，方差齐)或Dunnett's T3法(方差不齐)，P&<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 流式细胞仪检测B细胞纯度结果 每份标本分离纯化得到总B细胞约2×107个，流式细胞仪检测所得B细胞纯度为81.4%(见图1)
图1 流式细胞仪检测B细胞纯度的线形图
2.2 IFN-γ刺激不同来源B细胞产生抗体的含量变化 ELISA法检测IFN-γ刺激外周血B细胞和脐带血B细胞后，在第3、5、7d后均产生IgM，但未检测到IgG，空白对照组无任何抗体产生;各处理组不同时间点经统计学LSD法两两比较：IFN-γ分别刺激外周血B细胞和脐带血B细胞后从第3d开始IgM的含量升高，到观察的第7d一直呈上升趋势，各组均较前一时间点明显增高(见表1、图2)。同一时间点组间的比较：经IFN-γ刺激后外周血B细胞组与脐带血B细胞组相比产生IgM的含量没有太大差异，经LSD 法统计学分析后其差异无显著性(P&>0.05)。表1 IFN-γ刺激不同来源B细胞IgM(mU/L)表达量的ELISA检测结果注：同一时间点组间两两比较：外周血组vs 脐带血组★P&>0.05，各实验组内不同时间点的两两比较：与第3d比较◆P=0.0030、P=0.0010、○P&<0.0001;7d vs 5dP=0.0010、■P=0.0020
3 讨 论
在免疫系统中B细胞系是发育进化比较完善的细胞系，可在抗原的刺激下分化为浆细胞产生抗体参与机体的体液免疫应答。多年来研究发现， CD5+B1细胞来源于胎儿内脏的网膜，初次产生于胎儿期，并且能自我补充而维持到成人期，有文献报道[6]，人脐带血中CD5+B1细胞约占B细胞的60%～80%，正常成人外周血中CD5+B1细胞的含量很低，它主要存在于成人膜腔、胸膜腔、肠道固有层，一般作为第一道防线清除入侵的外来病原体和死细胞[7-8]，参与机体的固有免疫应答。在特定的自身免疫性疾病和免疫缺陷状态下，CD5+B1细胞受到细胞因子、抗原等外界刺激因素的作用增殖活化，并产生大量的病理性自身抗体，这些自身抗体主要为低亲和力的IgM与自身免疫性疾病的关系密切，自身抗体已作为自身免疫性疾病的诊断标志物，在某些自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、Graves，病、重症肌无力(MG)、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、强直性脊柱炎等患者体内均检测到自身抗体的含量上升[9-10]。
现已认识到IFN-γ作为一种重要的免疫调节因子，在免疫应答中起着重要作用，发现其能够诱导细胞处于抗病毒状态，抑制或刺激细胞增殖，诱生Ⅰ、Ⅱ类MHC抗原，激活单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞等[11]，且激活的细胞对IFN-γ的分泌又有反作用，他们之间的这种相互作用存在一种动态平衡，一旦平衡被打破将影响人体免疫功能，从而带来各种疾病。如APC能够分泌IL-12促进Th0向Th1细胞极化，Th1细胞分泌IL-12和IFN-γ刺激CD8+T细胞(细胞毒性T细胞，CTL)、自然杀伤细胞(NK)直接消灭抗原，起到细胞免疫功能的作用，与此同时，Th1 、CTL和NK细胞分泌的IFN-γ又能反馈性诱导APC产生更多的IL-12进一步使Th0向TH1细胞极化。Th1与Th3细胞分泌的细胞因子分别参与体液免疫和细胞免疫。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子介导细胞免疫(如肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞-CTL的细胞毒作用等)，而Th3细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子介导体液免疫，促进B细胞产生IgM和IgG等抗体[12，13]。在生理状态下，机体Th1细胞和Th1细胞相对处于动态平衡状态，它们调节着机体的免疫功能，当过多的Th0细胞向Th 2细胞转化时，可导致Th1细胞分泌的细胞因子减少从而影响人体细胞免疫功能。但是IFN-γ对CD5+B1细胞的调节作用及两者与自身免疫性疾病的关系研究较少。
因此我们从CD5+B1细胞分泌产生的抗体入手，研究CD5+B1细胞经过IFN-γ刺激后产生抗体的变化，从而探讨两者与自身免疫性疾病的关系。研究结果显示，两种来源的B细胞均在刺激培养后的第3d开始产生IgM，并随时间的延长抗体IgM的含量逐渐增多，直到第7d一直呈上升趋势(P&<0.01);经IFN-γ刺激后相同时间内外周血来源的B细胞产生IgM的浓度与脐带血来源的B细胞组相似，没有显著性差异(P&>0.05)。这说明， IFN-γ可以刺激B细胞产生IgM，也说明CD5+B1细胞和B2细胞经刺激后所产生的抗体在数量上没有差异，IFN-γ既能刺激B1细胞，也能刺激B2细胞。但是其产生IgM的具体差异与意义还有待于进一步研究。在此次试验中所有实验组和空白对照组培养上清液中都未检测到IgG，这可能是因为IgG是再次应答的主要产物，而IgM是初次应答的产物。然而IFN-γ是细胞因子，主要作用是调节B细胞的活性，直接刺激B细胞产生的抗体性质有待证实。IFN-γ有可能以模拟TI-Ag刺激的方式诱导抗体产生，通过Ⅲ型超敏反应机制诱导自身免疫病的发生，也可能B细胞活性增强后提高了对自身抗原的反应性，其具体的作用机制还有待于进一步研究。
另外，有研究发现， 单核细胞与淋巴细胞之间存在着交互作用和对话机制，而IFN-γ在介导单核细胞与淋巴细胞之间对话中发挥着关键作用[14]。IFN-γ还可以协同细胞因子IL-4、GM-CSF或IL-12诱导单核细胞向DC[15]或巨噬细胞[16]分化。此外，Naoki Koide 等[17]研究发现在不同剂量的IFN-γ作用下，可以诱导小鼠CD5+B1细胞向巨噬样细胞可逆转变，CD5+B1细胞转化为巨噬样细胞后，其应答的特异性增强，促进了体液免疫和细胞免疫。这提示，IFN-γ是否可以诱导人CD5+B1细胞发生巨噬细胞样改变，从而促进自身免疫应答的发生，还有待于进一步研究。
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