骨髓间充质干细胞研究进展

【摘要】 　　骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。

【关键词】 骨髓间充质干细胞 分化 标记

　　骨髓间充质干细胞(bone marrowderived Mesenchymalstem cells，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyforming unit fibroblast，CFUF)。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)。

　　1 骨髓MSCs的生物学特性

　　不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形 。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次［1］；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs特异性的细胞表面标记物［2］该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异［3］。

　　2 间充质干细胞移植后的免疫耐受性

　　在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受［4～7］。T细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加［8］。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。

　　3 促组织修复和细胞分化

　　骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adult stem cells，AS)，在一定的诱导条件下，BMSCs具有向成骨细胞、脂肪细胞，骨骼肌、软骨细胞平滑肌、肌腱细胞，造血支持基质等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞和心肌细胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚层横向分化的可塑性及其强大的分化潜能使得它可为组织修复提供可能性。
　　Kinnaird等［9］认为，干细胞可能通过旁分泌的机制来促使缺血局部的血管生长。在实验中发现，间充质干细胞在缺氧条件下，一系列有关血管生成的细胞因子的表达上调且分泌在培养基中。内皮细胞和平滑肌细胞的增生在这种培养基中被加强。而当这些培养基注射进动物的后肢缺血部位后，加速了缺血区的侧枝建立，改善了局部功能，降低了肌肉萎缩。Ziegelhoeffer等［10］在给后肢缺血动物模型注射GFP阳性干细胞后，没有发现表达内皮或平滑肌细胞标记的GFP阳性细胞，但在新生血管周围有大量GFP阳性细胞，而且一些生长因子染色阳性。在这个实验中还发现，在普通显微镜下呈现内皮或平滑肌细胞标记阳性的GFP阳性细胞，实际上是一种假阳性现象。当用激光扫描共聚焦显微镜观察时，发现这种阳性细胞实际上是两类细胞，一类表现内皮或平滑肌细胞标记阳性，另一类为GFP阳性细胞。很明显，一些结果之间差别很大，甚至是相互矛盾的。出现这样的情况可能有几种原因：（1）一般实验是将干细胞提取、体外培养后再注射到机体内。这个过程中，干细胞所处的人为环境和机体内环境相差很大，这就可能导致干细胞的生理功能受到影响，发生干细胞的分化，甚至失去分化的能力；（2）由于干细胞的数量很少，而且间充质干细胞并没有很特异的标志．这样就有可能导致提取的干细胞纯度不高，从而导致实验结果出现误差；（3）一些研究表明，干细胞在不同的器官或组织以及在不同的损伤中可能有不同的表现［11］。也就是说，干细胞完全有可能在不同的情况下表现出不同的分化方向。

　　4 骨髓间充质干细胞的标记

　　移植细胞的标记及在活体内的跟踪在此类研究中起着不可或缺的作用。目前的细胞标记方法主要有酶联标记HTDR标记，Brdu标记法等。BrdU为HTDR的类似物(analogue)，其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环与第五位氢原子被溴原子取代后的一种卤代物，当细胞处于DNA合成期，如有Brdu存在，会使其掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种存留是永久的，经免疫细胞化学染色后可直接观察其在细胞内的掺人情况。20世纪80年代以来，国外对Brdu的标记方法进行了大量研究，已证明能与 HTDR标记的结果有良好的相关［12］。机体组织和细胞中无内源性BrdU存在，BIdU被引入机体后能代替胸苷，由处于细胞增殖期的s期细胞特异性地摄入其细胞核。标记brdu的细胞在不受到紫外线照射的情况下对细胞没有功能损害。采用brdu标记骨髓间充质干细胞，并采用抗brdu单克隆抗体进行免疫组化染色，体外观察显示。48小时后细胞标记率＞90%。细胞的形态，生长，增殖及分化未受影响。细胞移植四周后，在实验动物体内仍可检测到标记细胞的存在。
　　
　　研究表明，BrdU标记结合免疫细胞化学技术和sHTDR放射自显影技术两种方法的观察结果十分相似，且前者具有无放射性污染、省时、操作简单、不需特殊设备，且迅速安全和标记效率高、准确性高等优点［13］。

　　5 临床应用

　　目前组织工程中细胞移植成为重要研究内容，其中BMSCs是继造血干细胞、胚胎干细胞后的又一研究热点。BMSCs是比较原始的细胞，可被定向诱导分化为临床所需的多种组织细胞。可取自自体骨髓，取材方便，且体外易培养，增殖快。并且由于来源于自体，BMSCs免疫原性较弱，能够抑制混合淋巴细胞反应，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题，亦不涉及伦理道德问题，因此通过体外培养扩增后的BMSCs是组织工程中理想的种子细胞。异体BMSCs注射到异染性脑白质营养不良患者发现没有反应性异常的T细胞出现和GVHD发生［14］ 异体移植骨髓MSCs在重度特发性再生障碍性贫血患者中植活也被证明，具有改善骨髓基质功能的作用［15］。

　　6 存在问题和展望

　　尽管近年来对骨髓MSCs的研究取得了很大进展，但仍然存在下列问题有待解决:（1）骨髓间充质干细胞缺少特异性表面标志物，对其鉴定困难，只能结合其形态和部分表面标志物进行综合判断。目前对于干细胞也仅限于功能上的定义，而没有足够的形态学和表型上存在的证据。因此在分离提取间充质干细胞时，由于对干细胞的特性尚缺乏足够的了解，使分离方法几乎不可能达到完全纯化；(2)BMSCs培养过程中的异质性，影响了干细胞分离纯化的效果。长期培养发现，BMSCs多次传代后，并不能保留其分化能力。对于传代后MSCs分化能力丧失的原因，近来有人认为与端粒酶缺失有关，依据是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓BMSCs，即使是早期的BMSCs也不能分化为软骨细胞和脂肪细胞［16］。
　　
　　尽管对间充质干细胞的特性还有很多未知，但由于BMSCs具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞。人们期望把BMSCs运用于临床疾病的治疗，比如心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。在这些领域的研究中有很多已经获得成功，因此BMSCs有着广阔的临床应用前景。

参考文献

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