热休克蛋白70与肾功能保护的研究进展

【关键词】 热休克蛋白 肾功能保护 防治

　　热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一组广泛存在于微生物和动、植物体内的生物进化中高度保守的多肽蛋白。它主要作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解，在细胞的生长发育、代谢分化、基因转录、维持组织细胞的自稳和环境适应性方面起着重要的作用。其中HSP70是HSP中最保守、最重要的一族，在大多数生物中含量最多，在应激反应中最敏感，因而是HSP中最受关注、研究最深入的一种。近年研究发现，HSP70具有保护细胞免受刺激损伤，促进受损细胞修复以及抗炎、抗凋亡作用，在肾脏保护中发挥着重要作用，HSP70与肾功能保护已成为国内外的研究热点。本文就HSP70的生物学特性与肾功能保护方面的研究进展作一综述。

　　1 HSP70的概述

　　1.1 HSP70的分类

　　HSP70家族包括4类蛋白质，即(1)HSP73，存在于细胞浆，是哺乳动物细胞内结构蛋白，属结构型HSP70，热刺激后只有少量增加； (2)HSP72，存在于细胞核，在正常细胞内只有少量表达，细胞发生应激后，表达迅速增加，属诱导型HSP70； (3)葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein，GRP)，位于内质网； (4)GRP75，位于线粒体内。HSP70概指HSP73和HSP72 ，这两种蛋白的氨基酸序列90％ 是相同的，它们的生化特性除了电泳泳动度稍有差异外，其余大部分特性都相同［1］。

　　1.2 HSP70的基因定位

　　Sorger 等首先阐明编码HSP的序列、基因结构及位点：人类HSP70基因结构不含内含子，HSP70及部分相关基因定位于第6、14、21对等染色体上，由2440个核苷酸组成，其中5 端、3 端分别含非编码的212与242个核苷酸序列，5 端上游是TATA盒(真核细胞启动子的一个元件，距转录起始位置30个核苷酸)和热休克元件(heat shock element，HSE) ［2］。

　　1.3 HSP70的结构及生物学特性

　　HSP70的一级结构可分为2个功能域，近N端为45kd大小ATP结合的结构域，近C端为25kd大小的底物结合结构域，近c端结构域可再分为15kd大小的beta夹层(betasandwich)结构亚区和近c端10kd大小的a～螺旋(ahelix)结构亚区［3］ 。HSP70的晶体结构已经确定，尽管HSP70的一级结构与ATP结合蛋白、己糖激酶和G肌动蛋白单体无同源性，但三者的折叠方式却非常相似，与ATP的结合可使3种分子出现球形构型的变化，HSP70水解ATP，引起蛋白质分子N端氨基酸构象的改变，并将其传递至c端引起多肽结构域构象及功能的改变。HSP70家族成员结构上的共性赋予其一些共同的生化特性：(1)所有的HSP70都具有较高的ATP亲和性及较弱的ATPase活性，结合ATP后的构象改变促使靶蛋白与之解离，ATPHSP70对靶蛋白具有更高的亲和力，形成HSP70蛋白复合体后稳定；(2)选择性结合各种多肽或1者特殊蛋白参与蛋白稳定构象的形成、跨膜转运或降解；(3)HSP70复合体的形成要靠其它HSP或细胞因子的辅助；(4) HSP70家族具有高度保守钙调素结合结构域。

　　研究发现，HSP70广泛存在于所有的原核和真核生物细胞，并在统一的生物体内的不同组织中均有不同程度的表达，并且具有高度的保守性，不同生物的HSP70的氨基酸序列有5O ～ 9O 的同源性。在正常的细胞中，HSP70的在胞浆中的表达水平较低，在应激情况下合成明显增加，聚集于核内并包围核仁，合成速度快，一般在几分钟到十几分钟内达到最高水平，同时HSP70表达水平与组织细胞抗损伤及自身保护能力关系密切，呈正相关，但HSP70应激和耐受机制有双刃剑样作用，其形成的应激耐力无特异性，而且HSP70的合成和功能存在生理老化现象［4～6］。

　　2 HSP70与肾损伤

　　2.1 细胞凋亡

　　有害应激包括热休克、氧化应激等可以导致细胞程序性死亡，即凋亡。目前已明确，细胞表面的Fas／ApoI受体和它们的配体相结合是诱导凋亡的重要原因，HSP70的表达可能提供一种能够包裹自身和外来抗原的新的免疫物质，从而使细胞避免凋亡［78］。应激诱导的细胞凋亡需要激活细胞内应激激酶。研究发现细胞内HSP72水平增高可以通过阻断信号通路，抑制应激诱导的JNK酶(cJunNh3terminal kinase)激活，从而减少细胞的凋亡。HSP72还能抑制另一种应激激酶P38(HOGI)活性，但当存在HSP70家族单克隆抗体时，这种抑制作用消除，P38活性提高，造成细胞损害，另外，他们还发现当细胞与氨基酸类似物一起孵育时，细胞内异常蛋白质积聚，将导致JNK、P38等应激激酶激活，这种激活现象也能被HSP72的过量表达阻断 。因此，在应激状态下，细胞内HSP70家族基因表达水平增加，可抑制应激激酶激活，防止细胞凋亡。线粒体可能是细胞选择死亡(炎症扩大)或凋亡(炎症受限)的关键细胞器，HSP70对线粒体保护也可能是HSP70的重要的抗凋亡机制 ［9］，Manucha w 等［10］还发现在新生儿梗阻性肾病中，HSP70通过调控线粒体通道，减少细胞Bax＼BcL的比例，从而抑制Caspase3来减少细胞凋亡。

　　2.2 肾间质纤维化

　　Mao H等［11］在单侧输尿管梗阻肾间质纤维化小鼠模型中，通过给予小鼠口服GGA选择性诱导HSP72表达，显著降低了肾小管上皮细胞的凋亡，同时降低了间质成纤维母细胞中的胶原沉积。在离体的人肾培养细胞NRK52E中，暴露TGFβ诱导肾上皮细胞纤维化和细胞凋亡，通过保留上皮细胞钙粘蛋白表达水平和α肌动蛋白来选择性诱导HSP72的表达可以抑制TGFβ诱导的肾上皮细胞纤维化。

　　2.3 肾缺血再灌注损伤

　　从Jennings［12］首次提出心肌的缺血一再灌注损伤以来，临床医生已经在大量的临床实践中认识到其重要性，并视之为可能影响病程转归的一个重要的因素。Yoshiok等发现短暂缺血的大鼠肾脏可获得对于再缺血或者其它不良损害的耐受性。目前认为，这种耐受性的获得也可能与诱导型HSP70有关。Guo S等［13］用3种不同方法造成MadinDarby canine kidney （MDCK）细胞缺血、缺氧，并研究HSP70的高表达对缺血的MDCK细胞内氧化还原反应的影响，结果显示在HSP70高表达时，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性比基础水平分别上调47%、55%，表明HSP70在缺血性应激中调整了GPx、GR的活性，从而调整了细胞内的氧化还原应激状态，这可能是HSP70在缺氧状态下保护细胞的机制。Zhang PL等［14］用基因微点阵法分析小鼠肾脏缺血再灌注损伤早期（缺血30分钟，再灌注3小时）的基因表达发现：包括HSP70在内的21组基因在肾缺血再灌注损伤中表达增加，用免疫组化和Western印记实验显示，受损近曲肾小管HSP70表达上调，说明肾缺血再灌注损伤时HSP70在肾细胞内的表达显著增高。

　　2.4 肾癌

　　肾癌是一种免疫原性很强的肿瘤，免疫治疗对肾癌有其独特的优势。研究证明，HSP70具有“伴移抗原肽”作用，其本身虽不是肿瘤抗原，但作为一种载体结合多种肿瘤抗原肽(抗原决定簇)，从肿瘤组织细胞中提取的HSP70可结合多种肿瘤抗原肽， 形成HSP70一肽复合物(HSP70一peptide complexes，HSP70一PC) ［15］ 。用HSP70一PC作为肿瘤抗原来致敏DC可越过鉴定肿瘤特异性抗原的障碍，又避免了全细胞性抗原的各种负面作用，将具有良好的应用前景。孟凡东等［16］采用亲和层析及离子交换层析法纯化肾癌细胞HSP70PC，体外致敏DC，流式细胞仪检测DC表型变化，用DC体外诱导CTL产生，MTT法比较其对不同肿瘤细胞的杀伤活性发现肾癌细胞中纯化的HSP70PC能有效地诱导DC成熟，并使其具有活化针对肾癌细胞的特异性CTL的能力。

　　2.5 肾移植

　　大量文献记载，HSP与同种移植排斥免疫有关，如器官保存、缺血／再灌注损伤、外科手术操作及排斥反应等过程中均可诱导其表达。Baba等［17］在同种异型和同型大鼠心脏移植中发现，前者HSP70 mRNA明显增高，且有时间依赖性，而后者增加则不明显，提示HSP参与排斥免疫。Duguesnoy等［18］在大鼠心脏移植慢性排斥反应中，移植物浸润T淋巴细胞的功能受到HSP70、71、72等的调节。张勇等［19］通过免疫组化法对兔同种异体原位肾脏移植后早期iHSP70的表达进行了研究，发现同种移植物排斥反应早期，HSP70的表达显著增高；移植物HSP70的表达与移植后早期排斥反应的发生具有相关性。从而提示，HSP70可能是参与排斥反应的重要因素之一。其机制可能是：淋巴细胞浸润导致组织损伤，引起HSP表达水平的提高。HSP分子结合APC递呈的自身抗原肽发挥“分子伴侣作用”识别暴露于变性蛋白表面的疏水性区域， 助其进行重新折叠，恢复其功能；另外，HSP将无法复原的蛋白质转移给蛋白质降解系统，使之降解，从而可避免细胞进一步受到伤害，起到对细胞的保护作用。而降解的变性蛋白可能产生自生抗原肽，与HSP蛋白结合后形成的HSP自身抗原肽复合体经APC加工处理和递呈给HSP特异性T细胞，引起T淋巴细胞的激活，从而引起移植物排异反应。

　　3 结 语
　　
　　HSP为一组高度保守的蛋白质，有其独特的生物学特性及功能，在生物体内广泛地参与了多种复杂的功能活动，有关这方面的研究仍在继续，已成为分子生物学的热点之一，且逐渐为临床多种疾病的治疗提供了新途径［20］。由于HSP70能够加强自身体内细胞本身抗损伤潜能，有效减轻肾缺血再灌注损伤及肾间质纤维化，若能阐明HSP70基因表达调控机制，通过无毒性的药物或基因转染等手段，诱导HSP7O局部合理表达，可使肾脏细胞耐受潜在损伤刺激的能力增加，将为创伤、外科手术或移植等病理生理过程中肾脏的保护提供一个新的有效途径。

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