肺炎动物模型研究现状及进展

【关键词】 肺炎动物模型 研究现状

当前细菌性肺炎（bacterial pneumonia）占成人各类病原体肺炎的80%。然而过去30～40年中，由于细菌耐药率的不断增高，大量广谱或超广谱抗菌素投入临床并未使肺炎的死亡率持续下降。有报告住院死亡病人约15%与肺炎有关。社区获得性肺炎(CAP)死亡率为5%～10%，而医院获得性肺炎(HAP)的病死率则高达20%～50%。肺炎的临床症状趋于不典型，所谓“重症”肺炎时有发生，尤其在婴幼儿、老年人和免疫抑制患者中病死率极高。提高肺炎的病原学诊断水平，建立肺炎的动物模型，确立肺炎的动物诊断标准和肺炎动物模型的观测指标，是临床处理重症肺炎迫切而急需解决的课题。
　　
　　国内外学者于上世纪上半叶先后建立了多种肺炎的模型，如卡氏肺孢子虫肺炎模型、衣原体肺炎模型、大肠杆菌肺炎模型、细菌性支气管性肺炎模型等，这些模型的建立为研究肺炎的发病机制和评价疗效奠定了基础。本文参考相关资料，综述近年的文献，旨在为同仁们提供更多有关肺炎模型相关研究的信息。

　　1 卡氏肺孢子虫肺炎模型
　　
　　卡氏肺孢子虫肺炎（Pneumocystis Carinii Pneumonia， PCP）为严重的机会性感染，多发生于AIDS病人和其他免疫缺陷或免疫抑制的病人。机理是基于各种原因造成机体免疫力、抵抗力下降，潜伏状态下的卡氏肺孢子虫大量生长繁殖，形成“潜伏状态再激活”，引起相应的病理改变和临床症状。早在上个世纪50年代中期，Weller［1］首先用考的松注射大鼠，同时注射青霉素以预防细菌感染，通过病理检查证实大鼠患有PCP，从而建立PCP动物模型。Frenkel［2］等于1966年对大鼠注射考的松，2次/周，在动物饮水中加入四环素以预防细菌感染。Hughes［3］等于1974年证实在蛋白质或热量摄入不足的情况下，更易诱导PCP的发生。经过几十年的发展，目前PCP模型的建立技术较为成熟。实验动物对象多为鼠科类，但也有用猪［4］或新西兰白兔［5］。最常用的模式为考的松类药物+抗菌药物+低蛋白质食物。此方式最早诱导出PCP时间多为6～8周。实验室采用这一方法最大的缺点就是易导致动物感染重度PCP，导致动物过早死亡，高死亡率的情况。动物低蛋白食物摄入，影响免疫球蛋白的合成，从而损害宿主免疫的免疫功能，促使肺孢子虫的繁殖和播散，加重宿主的感染度［3］。上个世纪90年代后期，国内学者［6］对上诉实验模式进行改进，增加实验动物蛋白质的摄入，从而使得PCP动物模型的病死率明显下降，寿命延长，更符合实验要求。目前国内文献报道［7］最早诱导出PCP时间为3周，较以前明显提前。国内有学者［8］采用半量诱导剂成功建立PCP模型，采用半量诱导剂使大鼠的死亡率由全量诱导剂的的70%下降至30%。于肺体检查出PC虫体为确诊PCP模型的成功建立。多采用以下三种方法：（1）肺印片检查 （2）支气管肺泡灌洗液检查（BLAs） 。三种检测方法以支气管肺泡灌洗液检查（BLAs）阳性率最高，约90%以上。以肺印片阳性率为最低，约为65%。

　　2 衣、支原体肺炎模型
　　
　　肺炎衣原体是人类较为常见的呼吸道感染致病源，易引起肺炎。由于此类肺炎症状较轻，到目前为止，人类对衣原体肺炎的肺部病理学改变尚不完全清楚［9］。为了对衣原体支原体肺炎的易感因素、抗生素的治疗效果以及宿主的免疫反应进行研究，国外学者先后在仓鼠、豚鼠等成功建立了肺炎支原体肺炎动物模型。国内学者分别于2001年、2004年以小鼠为实验对象成功建立肺炎衣原体肺炎模型［10］和肺炎支原体肺炎模型［11］。动物实验对象都采用鼠科类。肺炎衣原体肺炎模型建立中，按实验分组分别以鼻内接种或经静脉内接种衣原体菌液，分别于接种后的1、3、5、15、21、28、60天处死动物，通过检测肺炎衣原体lgG抗体、动物肺组织聚合酶链反应（PCR）、肺炎衣原体DNA扩增及组织病理学检查。实验结果发现鼻内接种的动物最早于接种后第7天发现lgG抗体，21天达到峰值。静脉接种动物的lgG抗体出现的更早。应用肺组织的PCR检查于接种后的14天内都可检测到肺炎衣原体DNA，21天后未再检测出阳性结果。在鼻内接种和经静脉内接种对比中，多可见类似病变，但无论病变程度还是病变范围都以静脉接种为轻。肺炎衣原体是一种专性细胞内寄生的病原体，可以在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中繁殖，并通过巨噬细胞进行传播［12］。在接种后的不同时间内都可见肺组织的病变，主要表现为不规则的间质性肺炎，肺组织出现一定程度的实变，肺泡壁充血，伴有较多的嗜中性粒细胞浸润。肺泡腔有大量炎性渗出，支气管周围可见大量嗜中性粒细胞浸润。以3～7天病变最为明显，14天后病灶明显减轻。1944年肺炎支原体第一次被确认为人类病原体，肺炎支原体肺炎模型建立中，实验组适当浓度支原体菌液经鼻滴入，对照组滴入相同剂量的生理盐水。分别在接种后的1、2、3、4、6、8、14、21天分批宰杀动物，留取各标本分别行肺组织匀浆肺炎支原体培养、肺组织PCR、血清干扰素γ、肺组织病理检查。结果表明，肺组织匀浆肺炎支原体培养于动物接种后的1、2、3、4阳性率为100%，之后，逐渐下降，14天以后阳性率为0。肺组织PCR检查与匀浆培养有类似的结果。血清干扰素γ于感染后第1天下降，于3、4天下降明显，之后逐渐恢复至正常水平。在组织病理学检查方面，采用曾用于仓鼠的肺炎支原体肺炎组织病理学评分系统评价［13］，这一评分系统最后总分能够客观评价大鼠肺炎程度。研究还表明，肺炎支原体肺炎模型未经任何治疗，随着时间的推移，肺部炎症及组织病理改变逐渐减轻，说明支原体肺炎有自限趋势的观点。

　　3 细菌性肺炎模型

　　3.1 克雷伯菌肺炎模型 肺炎克雷伯菌引起的医院内感染占革兰氏阴性菌所致院内感染的第二、三位［14］，国内学者童明庆［15］等于1994年率先在国内成功建立克雷伯菌小鼠细菌性支气管肺炎模型。模型中，用合适浓度的克雷伯菌液通过注射的方式接种处于免疫抑制状态的小鼠。然后通过记录接种后动物的临床表现、体温、血平板培养及肺组织病理检查。结果发现接种组小鼠较对照组体重明显减轻、体温明显升高，血平板培养全部阳性。接种组病理检查可见小支气管和细支气管内有渗出和中性粒细胞、淋巴细胞浸润出血。该模型的建立对肺炎的治疗和药效学研究具有重要价值。它的不足之处（1）动物使用了环磷酰胺、氢化考的松免疫抑制剂。（2）动物通过静脉注射的方式接种，与生理情况感染方式不符。国内学者王雪欣［16］等在没有使用免疫抑制剂的情况下用克雷伯菌菌液通过腹腔接种的方式接种动物，分别与接种后3、6、9、12、24h分批宰杀动物，留取标本测量血清肿瘤坏死因子α、胸腺、血培养及相关生化。结果发现，3h后经血培养和生化鉴定证实为肺炎克雷伯菌，血清中的TNFa与接种后3h开始升高，6h达到峰值，24h小时后逐渐降至正常值。电镜观察胸腺细胞可见典型的凋亡形态改变，早期可见细胞体积缩小，失去细胞连接和一些特殊细胞表面结构；中期可见核固缩，或裂解为一个或数个致密体；晚期可见致密体与其它细胞器成分形成具有完整膜性结构的凋亡小体。TNFa能增强中性粒细胞吞噬功能，诱导机体释放自由基、蛋白酶等炎性介质并形成细胞因子“级联效应”［17］。TNFa含量高低与感染的严重程度直接相关，重症感染血清中TNFa明显升高，而轻症感染TNFa水平相对较低，感染后的前3天此特征尤为明显。实验还发现，在肺炎克雷伯菌感染的前6h内，胸腺细胞的凋亡与TNFa有较好的相关性，分析TNFa在感染早期可能直接参与胸腺细胞凋亡的控制；而感染6h以后可能为TNFa早先激活其他调控因子而介导胸腺细胞的凋亡。

　　3.2 大肠杆菌肺炎模型 肺炎是严重危害老年人健康的常见感染性疾病，机体在各种应激状态下，可引起细菌易位。为探讨老年肺炎是否存在细菌易位、引起肠道损伤，国内学者李建生［18］等成功建立大肠杆菌肺炎模型并进行相关研究。模型中，适当浓度的大肠杆菌菌液经气管插管法接种动物。实验结果发现，老龄实验组动物血清和小肠组织TNF明显高于对照组，slgA的减少在实验老龄组中较对照组更为明显。SlgA主要存在于呼吸道和消化道粘膜表面分泌物中，对蛋白酶抵抗力强，有强有力的防御病原体侵害作用，使粘膜抗感染的一个重要因素。青年肺炎大鼠slgA明显高于对照组，表明肠道损伤的代偿反应。随着大鼠增龄，机体抵抗力降低，粘膜防御细菌侵入能力减弱，易致损伤的加重。研究还表明，大鼠大肠杆菌肺炎模型中，中性粒细胞、前列腺素及自由基介导肺炎的发生和发展，尤以老龄大鼠损伤更为严重。通过口服毒素清对大肠杆菌肺炎模型老龄大鼠有积极的干预作用。但这些模型多以青年动物为研究对象，忽视增龄因素对肺炎模型的影响。国内学者李建生等制作了老龄大鼠肺炎模型，这对研究老年肺炎的病理生理机制及干预措施具有重要意义。

　　3.3 白色念珠菌肺炎模型 近年来呼吸道真菌感染的发病率在逐步上升，主要原因是由于临床上广泛使用广谱抗生素、糖皮质激素、细胞毒类药物和免疫抑制剂，致使人体正常菌群失调。而机体免疫功能降低，诱发或促进真菌在体内的生长繁殖。适宜的动物模型将为研究白色念珠菌肺炎提供基础条件。国内学者马壮［19］等于2001年成功建立免疫功能低下大鼠白色念珠菌肺炎模型。模型中，皮下注射醋酸考的松致使大鼠免疫功能低下，于第二周气管内滴注适宜浓度白色念珠菌液，制成免疫功能低下合并白色念珠菌肺炎。实验结果发现，TNFα、IL6均明显低于免疫功能正常的大鼠。免疫功能低下的大鼠IFNγ、IL6水平明显低于免疫功能正常的大鼠。免疫功能低下的大鼠血中淋巴细胞毒作用明显低于免疫功能正常大鼠。免疫功能正常的大鼠肺组织白色念珠菌培养未见白念珠菌生长。以上实验表明此模型是免疫功能低下宿主肺部感染研究的适宜模型。

　　3.4 铜绿假单胞菌肺炎模型 糖皮质激素和细胞毒性药物被广泛用于恶性肿瘤的化疗及器官移植、免疫相关性疾病的免疫治疗，接受治疗的患者常常出现白细胞尤其是中性粒细胞（polymorphonuclear PMN）减少为主要特征的免疫损害，同时易并发铜绿假单胞菌（PA）肺部感染，临床上抗生素治疗效果不理想［20］，死亡率高。目前研究表明，对于免疫功能健全的宿主，PMN是PA肺部感染早期的主要炎性介质，在清除病原体的同时导致肺损伤。感染PA后，体内炎症介质的变化情况未见相关报道。为能模拟临床免疫功能降低病人感染PA后的炎症反应及其特点，国内学者李倬哲［21］等于2001年成功建立粒细胞减少大鼠铜绿假单胞菌肺炎动物模型。模型中，采用糖皮质激素联合环磷酰胺共同作用造成大鼠免疫功能下降、粒细胞减少。在此基础上，适宜浓度的铜绿假单胞菌菌液经气管接种大鼠，以模拟临床上常见的粒细胞缺少患者的肺部感染。实验结果表明，实验组大鼠体重较对照组明显减轻；外周血及细胞灌洗液（BALF）中白细胞较对照组明显减少；肺组织湿/干比（W/D）和BALF液中的总蛋白（TP）较接种前明显升高；实验组W/D、TP的改变与肺部中性粒细胞（PMN）浸润程度无明显关系。PA通过多种毒性因子直接损伤肺组织，当机体免疫功能下降时，PA可能大量繁殖从而直接损伤肺组织。对于长期住院、反复使用抗生素和细胞毒性药物等患者，在粒细胞减少的患者中PA感染的发病率和病死率均较高，且治疗困难。因此，选择PA作为致病菌对于研究粒细胞减少者肺部感染炎症反应具有一定的代表性。

　　3.5 金黄色葡萄球菌L型肺炎模型 通常情况细菌的重要抗原分布在细胞壁及其表面，细菌转变为L型后，由于细胞壁的缺失，常常不能有效促使机体免疫反应。也不能为机体特异性抗原所杀灭，使得L型菌逃脱机体免疫反应，长期在体内存活。L型菌在机体内能否致病，其发病机制及病理生理变化，目前仍有争论。为探讨L型菌的致病情况，国内学者单绍臣［22］于2002年建立金黄色葡萄球菌L型致间质性肺炎动物模型。结果发现，金葡菌L型致病力不同程度减弱。但仍具侵入和破坏组织、细胞的能力［23］。

　　3.6 重症细菌性肺炎动物模型 当前重症肺炎的治疗，抗菌素治疗效果并不理想。仍然表现为疗效差，死亡率高等特点。国内外学者正在积极探索对重症肺炎新的治疗途径，如细胞因子、免疫治疗等。为此，迫切需要建立细菌性重症肺炎的动物模型，以用于对重症肺炎治疗新途径的实验性治疗和药效学研究。但是，建立重症肺炎动物模型在实践上有一定困难。首先，临床上重症肺炎目前国内外尚无统一的诊断标准。美国胸科学会(ATS)1993年提出重症肺炎的界定是：（1）呼吸频率&>30次/分；（2）PaO2&<60mmHg、PaO2/FiO2&<300，需行机械通气治疗；（3）血压&<90/60mmHg；（4）胸片显示双侧或多肺叶受累，或入院48h内病变扩大≥50%；（5）少尿、尿量&<20ml/h或&<80ml/4h，或急性肾功能衰竭需要透析治疗。但此标准一直未得到国际统一认识。有学者提出有关重症肺炎诊断的八条标准。认为高热或体温不升，高危病原体感染，宿主状态如免疫抑制归入预后危险因素，而不作为重症肺炎的界定标准。其次，接种菌液的浓度和剂量的选择。浓度和剂量过大，可能导致动物的死亡；浓度和剂量过小，可能导致接种的不成功。经过反复预实验，我们于2005年成功建立重症肺炎动物模型［24］，此模型为研究肺炎的发病机制和病理生理过程奠定了基础。在此基础上，我们测定了重症肺炎动物模型细胞因子的变化情况［25］。
　　
　　细胞因子在重症肺炎发病中的作用日益引起医学界的重视，近年来研究表明，细胞因子的过度表达及其相互作用是发生重症肺炎的重要原因，调控机体炎症反应将是治疗重症肺炎的重要手段。目前已明确，在重症肺炎中IL6、IL8、IL10和TNFα水平的活性显著增高，多项研究说明，血清IL6水平于疾病严重程度相关，IL6可用于评价全身炎症反应的程度，可作为监测炎症治疗后指标［26］。IL8是介导PMN聚集的关键因子，是一个与PMN聚集在急性肺损伤肺内及体液中最有恒定关系的因子。IL8不仅起到PMN化学趋化因子和激活因子的作用，同时可以增强PMN表面与ICAM1结合的CD11b/CD18(MCA1)的结合活性［27］。IL10是由辅助性T淋巴细胞2（Th3）产生的细胞因子，也可由巨噬细胞/单核细胞、B细胞、肥大细胞、肝细胞及多种肿瘤细胞分泌。TNFа是创伤或感染后机体最早产生的多功能细胞因子之一，TNFа可诱导IL10及IL4合成，而IL4和IL10可强烈抑制TNFа、IL1、IL6等炎性介质合成［28］。血清干扰素γ是TH1细胞分泌的一种具有代表性的抗炎细胞因子。有文献报道在小鼠支原体性肺炎模型中，在检测疾病的不同阶段的血清干扰素γ的含量时发现：随着肺炎的加重，血清干扰素γ的含量会逐渐降低；随着肺炎的时间的延长、肺炎的减轻，血清干扰素γ的含量逐渐恢复到正常对照组水平。可能表明炎症抑制血清干扰素γ的生成或加速血清干扰素γ的降解。细胞因子在重症肺炎病程中作用多种多样，细胞因子的产生、生物学作用、受体表达和相互调节都具有网络学特性，细胞因子之间的相互作用，相互调节决定了重症肺炎的发生和发展。

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