稳定性氢同位素分析在牛肉产地溯源中的应用

　　　　 作者：郭波莉 魏益民 Kelly D. Simon 潘家荣 魏帅

【摘要】 探讨了利用高温热解炉和同位素比率质谱仪(IRMS)联用测定肉品中稳定性氢同位素比率的方法，并利用此方法测定了我国不同地域来源脱脂牛肉、牛尾毛中氢同位素比率。分析了牛组织中氢同位素组成与地域经度、纬度及海拔高度变化的关系，以及稳定性氢同位素用于牛肉产地溯源的可行性。结果表明，不同地域来源牛组织中δ2H值的差异显著，其与当地饮水中氢同位素组成密切相关，而且有随着地理纬度增加而减小的趋势; 牛尾毛与牛肉中δ2H值的相关性显著。稳定性氢同位素是用于牛肉产地溯源的一项很有潜力的指标，且牛肉和牛尾毛中的氢同位素组成均可反映牛来源地的信息。

【关键词】 牛肉，产地，溯源，稳定性氢同位素

　　　1 引 言

　　随着食品生产和贸易的全球化发展，以及食品安全事件的频繁发生，各国政府、食品监管部门和消费者日益关注食品的产地来源。高精度的稳定性同位素天然丰度分析是目前被认为追溯食品产地来源的一项有效技术。生物体中稳定性碳、氮同位素测定方法比较成熟，测定结果比较稳定，常用于植源性食品的掺假鉴别和来源鉴别，以及动物膳食和营养级的研究。20世纪90年代，随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等动物疫病疫情的不断发生，有学者相继将稳定性同位素分析技术用于奶制品，包括鲜奶[1，2]、奶酪[3～5]、黄油[6]和肉制品，包括牛肉[7～10]、羊肉[11，12]、猪肉[13]和鸡肉[14]的产地溯源研究。但目前，稳定性氢同位素用于动物食品产地溯源的研究还比较少[12，15]。这主要由于生物体中稳定性氢同位素测定方法还不成熟，而且生物体中部分氢不断与周围环境的水中的氢发生交换。本研究利用高温热解炉与同位素比率质谱仪联用测定牛组织中氢同位素比率，分析了测定方法的稳定性和精确性，并分析了我国不同地域来源牛组织中稳定性氢同位素组成差异，探讨了稳定性氢同位素组成用于我国牛肉产地溯源的可行性。

　　 2 实验部分

　　2.1 实验材料

　　从吉林省榆树市、贵州省安顺市、宁夏自治区同心县和河北省张北县4个地点共采集了61头牛的牛肉样品和对应的牛尾毛样品。采样点的具体情况见表1。表1 样品来源地及当地饮水中年平均δ2H值

　　 2.2 实验方法

　　2.2.1 采样方法 牛肉：屠宰后在每头牛的后臀部取500 g肉，装入自封袋中在-20 ℃冰箱中冷冻保藏;牛尾毛：在每头牛的尾部紧贴皮层剪取1 cm2牛尾毛，用细线系住根部，装入自封袋中冷冻保藏。

　　2.2.2 样品前处理 牛肉：取50 g牛肉样品冷冻干燥后，加入沸程为60～90 ℃的石油醚，采用索氏提取器进行脱脂处理[7]。脱脂后的牛肉粉进行研磨，备用。牛尾毛：剪取靠近根部4 cm的牛尾毛样品，用去离子水浸泡清洗，在60 ℃恒温干燥12 h，用氯仿甲醇(2∶1， V/V)混合液浸泡2 h进行脱脂，用去离子水清洗、浸泡30 min，再用氯仿甲醇 (2∶1， V/V)混合液浸泡。最后用去离子水清洗、60 ℃干燥，剪成1～2 mm备用[9，10]。

　　 2.2.3 稳定性氢同位素比率测定 称取1 mg样品装入银杯中(高6 mm， 直径4 mm)，每个样品重复3次。将银杯按照顺序放在酶联免疫板中，盖上盖子，在实验室的室温环境下平衡72 h。然后包裹样品，并把其装入与高温热解炉相连的旋转自动进样盘中。高温热解炉内的柱子是由装有玻璃碳细片的Al2O3管组成，测定样品时热解柱的温度为1280 ℃，与其相连的气相色谱柱(GC)的温度为85 ℃。气相色谱柱中装有5 nm的分子筛柱，用于把高温裂解生成的h3和CO气体分离。h3在载气He气的载带下经过稀释仪，最后进入Thermo Finnigan DELTAPlus XP同位素比率质谱仪(IRMS)进行检测。载气氦气流量为80 mL/min。 He稀释压力为50 kPa，h3参考气压力为50 kPa。测定时用酪蛋白标准品(Casein IHR)作为内标准物，并用胶原蛋白标准品(Collagen ICM)和牛肝脏标准品(NIST 8414)检测仪器的精确度。稳定性氢同位素比率以δ2H(‰)表示，δ2H的相对标准为VSMOW。计算公式为：δ(‰)=(R样品/R标准-1)×1000其中，R为轻同位素与重同位素丰度比，即2H/1H。

3 结果与讨论

　　3.1 氢同位素检测结果重复性和精确度分析

　　以酪蛋白标准品(Casein IHR)为内标物做标准曲线，对胶原蛋白标准品(Collagen ICM)和牛肝脏标准品(NIST 8414)中的氢同位素测定结果进行校对。从表2可知，6个胶原蛋白和牛肝脏标准品中氢同位素比率的标准偏差均很低，分别为1.1‰和0.8‰，这说明测定结果的稳定性很好。胶原蛋白和牛肝脏标准品中氢同位素的测定结果与可接受值比较可以看出，两者差异很小，分别为0.1‰和1.8‰，这说明测定结果的准确性很高。由此可见，本方法可直接用于有机体中氢同位素比率的测定，且测定结果具有很高的稳定性和精确性。表2 标准品中氢同位素测定结果

3.2 不同地域来源牛组织中氢同位素组成差异分析

　　从表3可见，不同地域来源脱脂牛肉、牛尾毛中稳定性氢同位素组成均有显著性差异，且有随着纬表3 脱脂牛肉和牛尾毛中的δ2H值度的增加而减小的趋势，但它们与经度、海拔高度的变化规律不明显。将不同地域脱脂牛肉中δ2H值与当地年平均水中δ2H值比较可以看出，脱脂牛肉中δ2H值与当地水中δ2H值紧密相关，两者变化规律一致。这说明脱脂牛肉中氢同位素组成与牛的饮水密切相关。

　　3.3 脱脂牛肉和牛尾毛中氢同位素组成的相关分析

　　牛尾毛与脱脂牛肉中δ2H值有极显著的相关性(r=0.539， P&<0.01)，如图1所示。这表明牛尾毛与脱脂牛肉对饮水中氢同位素变化的响应模式一致，两者都可反映饮水中氢同位素的组成，反映牛生长的地域环境。但由于两种组织对水中氢同位素的平衡时间可能存在差异，其反映的环境变化也可能存在一定的时间差异，这需要进一步分析。 图1 牛尾毛与脱脂牛肉中δ2H值的相关关系

　　我国不同地域来源的牛肉和牛尾毛中氢同位素组成有极显著差异，其与当地水中氢同位素组成密切相关，有随着纬度的增加而减小的趋势。这与前人的研究结果一致。Kelly等[16]研究发现鸟羽毛中的δ2H与其地域的纬度呈显著负相关(r=0.52)。Heaton等[15]对来自欧洲、美洲、澳大利亚和新西兰的牛脂肪中δ2H值分析发现，来自高纬度地区如苏格兰、新西兰、设得兰群岛、英格兰等的牛脂肪中δ2H值比较低，来自低纬度地区如南非、澳大利亚、巴西和乌拉圭的牛脂肪中δ2H值比较高，而且牛脂肪中的δ2H值与来源地的纬度呈显著负相关(r=0.74)。O′Brien等[17]对美国不同居住地的现代人毛发中的δ2H值分析结果也发现，居住在纽约(低纬度地区)的人毛发中δ2H值明显高于居住在阿拉斯加州(高纬度地区)的人，且人毛发中的δ2H值与当地水中的δ2H值密切相关，即人毛发中的δ2H值也符合纬度效应。此外，他们通过混合模型分析得出人毛发中约36%H来自饮水[17]。动物组织中的δ2H值不但具有明显的纬度效应，也具有内陆效应和高度效应，即生长在距离海洋越近的地域，其组织中δ2H值就越高;生长在海拔高的地区，其组织中的δ2H值越低。Camin等[12]对欧洲不同地域来源的羊肉中δ2H值分析结果表明，来自希腊(东地中海地区)的脱脂羊肉样品中δ2H值比较高，平均值为-80‰;来自英国海岸地区的康奥尔、奥克尼羊肉样品中δ2H值在-80‰～-90‰之间;来自中欧地区，如西班牙和意大利的羊肉样品中δ2H值在-90‰～-100‰之间;来自阿尔卑斯山的羊肉中δ2H值比较低，在-100‰～-115‰之间。目前，有关学者对动物组织中的δ2H值具有明显的纬度效应和内陆效应的认识比较一致，但关于高度效应，研究结果还存在异议。Hobson等[18]对厄瓜多尔安第斯山脉的蜂雀进行研究发现，在高度为400 m以上的区域，蜂雀羽毛中的氢同位素比值(δ2H)随着高度的增加而降低(r=0.53，P&<0.001);在高度为1300～3120 m的范围内，鸟羽毛中的δ2H值与高度也呈显著负相关(r=0.34，P&<0.001)。他们认为，羽毛中的δ2H是研究鸟迁徙高度或群居高度比较好的指标。但Kelly等[16]研究却发现威尔逊鸣鸟羽毛中δ2H与高度之间的相关性不显著。本研究中，脱脂牛肉样品中的δ2H值与其来源地域的海拔高度也没有明显的变化规律。这还需要进一步研究探讨。

参考文献

　　1 Camin F， Perini M， Colombari G， Bontempo L，Versini G. Rapid Communications in Mass Spectrometry， 2008， 22： 1690～1696

　　2 Crittenden R G， Andrew A S， LeFournour M， Young M D， Middleton H， Stockmann R. International Dairy Journal， 2007， 17： 421～428

　　3 Camin F， Wietzerbin K， Cortes A B， Haberhauer G， Lees M， Versini G. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52: 6952～6601

　　4 Pillonel L， Badertscher R， Froidevaux P， Haberhauer G， Hlzl S， Horn P， Jakob A， Pfammatter E， Piantini U， Rossmann A， Tabacchi R， Bosset J O. LebensmittelWissenschaft undTechnologie， 2003， 36: 615～623

　　5 Manca G， Camin F， Coloru G C， Caro A D， Depentori D， Franco M A， Versini G. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49： 1404～14096 Rossmann A， Haberhauer G， Hlzl S， Horn P， Pichlmayer F， Voerkelius S. European Food Research and Technology， 2000， 211： 32～40

　　7 Boner M， Frstel H. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 378： 301～310

　　8 Schwertl M， Auerswald K， Schufele R， Schnyder H. Agriculture， Ecosystems and Enviroment， 2005， 109： 153～165

　　9 Guo BoLi(郭波莉)， Wei YiMin(魏益民)， Pan JiaRong(潘家荣)， Li Yong(李 勇). Scientia Agricultura Sinica(中国农业科学)， 2007， 40(2)： 365～372

　　10 Guo BoLi(郭波莉)， Wei YiMin(魏益民)， Pan JiaRong(潘家荣). Scientia Agricultura Sinica(中国农业科学)， 2008， 41(7)： 2105～2111

　　11 Piasentier E， Valusso R， Camin F， Versini G. Meat Science， 2003， 64: 239～247

　　12 Camin F， Bontempo L， Heinrich K， Horacek M， Kelly S D， Schlicht C， Thomas F， Monahan F J， Hoogewerff J， Rossmann A. Anal. Bioanal. Chem.， 2007， 389： 309～320

　　13 Martin I G， C Pérez G， Méndez J H， Macias E M， Poveda F S. Meat Science， 1999， 52： 437～441

　　14 Bettina M F， Koslitz S， Micaux F， Piantini U， Maury V， Pfammatter E， Wunderli S， Gremaud G， Bosset J O， Hadorn R， Kreuzer M. European Food Research and Technology， 2007， 225： 501～509

　　15 Heaton K， Kelly S D， Hoogewerff J， Woolfe M. Food Chemistry， 2008， 107： 506～515

　　16 Kelly J F， Atudorei V， Sharp Z D， Finch D M. Oecologia， 2002， 130： 216～221

　　17 O′Brien D M， Wooller M J. Rapid Communications in Mass Spectrometry， 2007， 21： 2422～2430

　　18 Hobson K A， Bowen G J， Wassenaar L I， Ferrand Y， Lormee H. Oecologia， 2004， 141： 477～488