作者：宋爱英，杨丹，曹德胜，李威，王丽芹
【摘要】 目的 研究平调饮对原发性肝癌患者甲胎蛋白(AFP)mRNA、黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)mRNA表达的影响，探讨平调饮对原发性肝癌的抑癌基质。方法 原发性肝癌患者60例，随机分为治疗组和对照组，分别给予平调饮和华蟾素注射液，治疗2个疗程，采用RT-PCR技术检测原发性肝癌患者治疗前后外周血AFPmRNA、MAGE-1mRNA的表达，并取30例健康志愿者血样作为参考对照，结果用SPSS13.0软件统计。结果 平调饮使原发性肝癌患者的AFPmRNA、MAGE-1mRNA表达明显降低，2组治疗前后比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，治疗后治疗组与对照组MAGE-1mRNA表达(灰度比)分别为0.07±0.01、0.13±0.02，组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)，治疗组作用优于对照组。结论 平调饮能够明显降低原发性肝癌患者AFPmRNA、MAGE-1mRNA表达，对MAGE-1基因表达的降低作用优于对照组，说明抑制MAGE-1基因表达可能是平调饮抗肝癌机制的靶点之一。
【关键词】 原发性肝癌；平调饮；黑色素瘤抗原-1基因；甲胎蛋白基因
Abstract：Objective To study the changes of expression of AFPmRNA and MAGE-1mRNA in hepatocellular carcinoma (HCC) after oral Pingtiaoyin therapy， and explore its inhibitory action to HCC. Methods Sixty patients with HCC were randomly pided into treatment group (n＝30) and control group (n＝30). Oral Pingtiaoyin therapy and injection of Huachansu were given for two courses of medical treatments to treatment group and control group respectively. RT-PCR was used to detect AFPmRNA and MAGE-1mRNA expression in peripheral blood of patients before and after treatment. At the same time， 30 healthy volunteers were selected as the control. The data was analyzed by statistics of software SPSS13.0. Results The expression of AFPmRNA and MAGE-1mRNA were markedly decreased after oral Pingtiaoyin therapy. There was significant differences between before and after treatment in two groups (P＜0.01). The brightness ratio of the strap of MAGE-1 vs β-actin after treatment in the treatment group and the control group was 0.07±0.01 and 0.13±0.02 respectively (P＜0.01)， the result of the treatment group was better than that of the control group obviously. Conclusion Pingtiaoyin can effectively suppress the expression of AFPmRNA and MAGE-1mRNA in peripheral blood of human HCC， it was better than the control group in decreasing the expression of MAGE-1mRNA. Suppressing the expression of MAGE-1mRNA is possibly one of the function targets of the anti-tumor mechanism of Pingtiaoyin.
Key words：hepatocellular carcinoma；Pingtiaoyin；MAGE-1mRNA；AFPmRNA
原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma)是世界十大恶性肿瘤之一，据统计，每年全球新患肝癌人数为62.6万人，因肝癌死亡者高达59.8万人，居死亡原因第3位，而新发肝癌病例中55%发生于中国，我国的肝癌诊治形势十分严峻[1]。手术切除目前仍是肝癌首选的、最有效的治疗方法，但在临床中大多数肝癌患者在确诊时已属中晚期，手术机会多已错过，且放、化疗毒副反应大，疗效较差。中医药作为综合治疗的组成部分，因其能稳定瘤体生长、改善症状体征、提高生存质量、延长生存期，故已被较多患者所接受。平调饮由黄芪、当归、白芍、熟地黄、蚤休等药物组成，是黑龙江中医药大学附属第一医院基于多年临床实践创立的中药复方，在临床应用多年，对瘤体具有明显的抑制作用，并有提高患者生活质量、延长生存期的作用。为阐明其抗肝癌机制及为临床应用提供依据，我们观察了平调饮对肝癌患者甲胎蛋白(AFP)及黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因表达的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2007年10月—2009年10月黑龙江中医药大学附属第一医院住院和门诊原发性肝癌患者60例，随机分为2组。治疗组30例，男17例，女13例，平均年龄55.7岁；对照组30例，男20例，女10例，平均年龄56.7岁。2组患者性别、年龄、病程、病情轻重程度等方面差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。健康组来自门诊体检的健康志愿者，共30例，男性15例，女性15例，平均36.2岁。
1.2 诊断标准
符合1999年第四届全国肝癌学术会议提出的原发性肝癌临床诊断标准[2]。病理诊断：肝内或肝外病理学检查证实为原发性肝癌。临床诊断：①AFP＞400 ?g/L，排除活动性肝病、妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤及转移性肝癌，并能触及坚硬及有肿块的肝脏或影像学检查具有肝癌特征性占位性病变者；②AFP≤400 ?g/L，有2种影像学检查具有肝癌特征性占位性病变或有两种肝癌标志物阳性及一种影像学检查具有肝癌特征性占位性病变者；③有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。
1.3 纳入标准
①全部病例均经明确的MRI、CT等影像学检查，结合AFP或肝穿刺病理确诊；②患者年龄在18～75岁；③如经手术、放疗、化疗、介入治疗、射频消融等抗肿瘤治疗，已结束1个月以上，而仍有实体瘤者；④卡氏评分60分以上；⑤预计生存期3个月以上；⑥自愿接受临床观察者。
1.4 排除标准
①继发性肝癌；②不符合以上纳入标准者；③合并有严重心脑血管疾病、肾脏疾病、造血系统等原发性疾病以及精神病患者；④正在服用其他中药抗癌制剂或免疫调节剂(生物制剂)的患者；⑤过敏体质或对本制剂过敏者。
1.5 治疗方法
治疗组采用常规保肝治疗，同时口服平调饮(黑龙江中医药大学药厂制备)，每日早晚各1次，每次150 mL。
对照组采用常规保肝治疗，同时予华蟾素注射液(批号030301、050515、060120，安徽金蟾生化股份有限公司，皖卫药准字82884号)15 mL＋5%葡萄糖溶液250 mL静脉滴注，每日1次。
2组均每3周为1个疗程，疗程间休息1周，共治疗2个疗程。治疗中停止使用其他抗癌药物，但允许必要时短时间给予对症或支持治疗。
1.6 观察指标与方法
治疗组和对照组患者分别于用药前、用药后抽取周围静脉血液各10 mL，健康志愿者抽取一次10 mL静脉血，采用常规方法分离单个核细胞，-70 ℃保存。采用RT-PCR方法对AFPmRNA、MAGE-1mRNA表达进行检测，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，具体方法如下：①采用Trizol法提取标本的总RNA，溶于DEPC处理过的水中。取少量样本行分光光度测定和2%琼脂糖凝胶电泳，以测定其纯度、浓度和完整性。②按照标准流程，单个试剂(M-MLV RT由Promega生产，货号ML701；Rnase Inhibitor由宝生物工程有限公司生产，货号D2313A；dNTP Mixture由宝生物工程有限公司生产，货号D4030A)逐一完成反转录。MAGE-1mRNA引物1：5’-TCTGTGAGGAGGCAAGGT-3’，引物2：5’-TGA TGGTAGTGGGAAAGG-3’；AFPmRNA引物1：5’-GCTGACCTGGCTACCA TA-3’，引物2：5’-AACTGTTGCTGCCTTTGT-3’。反转录反应体系为20 ?L，37 ℃下扩增60 min，95 ℃下变性5 min，4 ℃保存。聚合酶链反应体系为50 ?L，94 ℃下预变性5 min，94 ℃下变性30 s，72 ℃下延伸30 s；重复变性、退火、延伸35个循环；72 ℃下充分延伸10 min，结束温度为4 ℃。取5 ?L产物，80 V下经2%琼脂糖凝胶电泳30 min，利用凝胶电泳成像系统拍照，获取条带密度值和面积数据，利用与内标基因(ACTBmRNA)扩增产物的灰度比反映各基因转录表达水平。
1.7 统计学方法
所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据均用—(—进)±s表示，以P＜0.05和P＜0.0l表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 平调饮对原发性肝癌患者AFPmRNA表达的影响
2组治疗前后AFPmRNA表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)；2组治疗后AFPmRNA表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)；2组治疗后与健康组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。表1 平调饮对原发性肝癌患者AFPmRNA表达(灰度比)的影响(略)
2.2 平调饮对原发性肝癌患者MAGE-1mRNA表达的影响
2组治疗后MAGE-1mRNA表达均明显降低(P＜0.01)，但对照组治疗后仍高于健康组(P＜0.05)；2组治疗后MAGE-1mRNA表达比较差异有统计学意义(P＜0.01)，平调饮组作用优于华蟾素注射液组。结果见表2。表2 平调饮对原发性肝癌患者MAGE-1mRNA表达(灰度比)的影响(略)
2.3 RT-PCR结果
ACTBmRNA、AFPmRNA和MAGE-1mRNA PCR产物分别为475、498、359 bp，在2%琼脂糖凝胶电泳上可见清晰明显的条带(见图1)。内参照ACTB的表达在各组间无明显差异，治疗组与对照组治疗后AFPmRNA和MAGE-1mRNA的表达均比治疗前明显降低。
3 讨论
原发性肝癌属于中医学“积聚”、“黄疸”、“臌胀”、“胁痛”、“癥瘕”等范畴，具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、易转移、预后差等特点。中医学认为，肝癌的病因病机外有六淫之邪侵袭人体，内有饮食不节、七情内伤、肝脾肾虚损等因素导致气机阻滞、瘀血内停、湿热郁蒸、火毒蕴结，日久而成。但作为外因的致病因素，一定要在阴阳不和、气血亏虚和脏腑功能失调等内在虚损的基础上才能导致癌瘤的发生，即所谓“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”。临床上，原发性肝癌的患者多表现为脏腑虚损、气血不足、阴阳失调，以阴血虚为主。平调饮是基于多年临床实践创立的中药复方，具有补益气血、调整阴阳、解毒散结的功效，本方以补血滋阴药味居多，经临床观察治疗效果良好。近些年中药治疗肝癌的研究逐渐增多，但大多停留在抑瘤作用的动物实验和临床观察阶段，或单味药对肝癌治疗作用的研究，未见复方中药对肝癌患者MAGE-1mRNA与AFPmRNA表达影响的系统研究报道。中药复方是中医辨证施治的体现，经过配伍更能发挥重要的作用。当前，肝癌的治疗多采取西医结合">中西医结合的综合治疗方法，西医更多注意的是局部治疗，而中医重视的是整体调理，因人而异，辨证施治，若二者有机结合，取长补短，定会相得益彰。
MAGE是一类肿瘤特异性抗原，由位于X染色体长臂末端的MAGE基因家族编码，由至少12个基因成员组成[3]。在肝癌组织中，MAGE-1基因呈特异性高表达[4-5]，而在肝硬变和正常肝组织中不表达。有研究表明，只有肝癌组织表达MAGE-1基因的原发性肝癌患者外周血中，才有可能检测到相对应的MAGE-1mRNA，而健康志愿者外周血中未检测到MAGE-1基因表达[6]。AFP基因位于第4号染色体上，主要由胎儿肝细胞和卵黄囊合成，出生后即随白蛋白的合成增多而迅速下降。AFP基因在正常成人肝细胞中仅微弱表达，在肝癌细胞中高表达。作为肝癌肿瘤标志物，据Yamashita等[7]报道，原发性肝癌患者癌组织中MAGE-1基因的阳性表达率为80%(16/20)，Matsumura等[8]用巢式RT-PCR检测肝癌患者外周血中的AFPmRNA，结果表明，33例患者中AFPmRNA的阳性率为52%(17/33)。因而，联合检测外周血中MAGE-1mRNA与AFPmRNA，二者互补，能增加检测的特异性，提高准确率。
本研究结果显示，平调饮使原发性肝癌患者的AFPmRNA、MAGE-1mRNA表达明显降低，且在降低MAGE-1mRNA表达方面治疗组作用优于对照组(P＜0.01)。平调饮为口服给药，患者痛苦小，毒副反应轻，不失为一种较为理想的非手术治疗肝癌的有效药物。对于平调饮的抑癌机制，我们将进一步探讨和研究。
参考文献
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