作者：安惠霞，斯拉甫?艾白，古力娜?达吾提，李治建
【摘要】 目的 对地锦草不同萃取部位进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度值(MIC)。方法 采用溶剂萃取法分离地锦草乙醇提取液，得到水、石油醚、氯仿、正丁醇等4个萃取部位;根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，测定地锦草各萃取部位对23株临床常见皮肤癣菌的MIC。结果 由于地锦草萃取分离后的石油醚和氯仿部位在药敏试验中的溶解度甚小，影响结果的科学观察，本研究主要针对正丁醇和水部位的体外药敏进行了检测，正丁醇和水部位对真菌有明显的抑制作用，并且正丁醇部位的作用优于水部位。结论 地锦草萃取部位具有体外抗真菌作用。
【关键词】 地锦草;M38-A方案;体外试验;抗真菌作用;最低抑菌浓度
Abstract：Objective：To examine the antifungal effect of different extraction parts of Euphorbia humifusa in vitro， and measure the minimum inhibition concentrations (MICs). Methods Separated the Dijincao extract and got four parts by solvent extraction. Applied the standard which was approved by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)：Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous， Fungi (M38-A). MICs of different parts of Dijincao extract against 23 strains of common clinical dermatophytes were investigated. Results Chloroform extract and petroleum ether extract could not get clear and definite MIC because their solubility disturbed the determination of experiment’s results. However， water and n-butanol fraction could get definite and clear results. Both of these two parts could clearly inhibit fungal growth. Conclusion Euphorbia humifusa extract parts have antifungnal activity against dermatophytes in vitro. Key words：Euphorbia humifusa extract parts;M38-A;antifungal effect;in vitro;MIC
地锦草，维吾尔名为夏塔热其尼(Xiahatereqini)、雅丽蔓(Yalmankulake)，为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病[1]。研究发现，地锦草具有显著的抗皮肤癣菌作用[2-3]。为进一步明确其化学成分与药效之间的相关性，本研究通过化学萃取分离方法将地锦草主要化学组分分成4个部位，并参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[4]，探讨其各部位的体外抗真菌活性。
1 材料与方法
1.1 药物
地锦草药材由新疆维吾尔医药研究所药剂室提供，经生药学鉴定为大戟科植物地锦草(Euphorbia humifusa Willd.);
阳性对照药：盐酸特比奈酚(TBF)，瑞士诺华公司，批号010482。
1.2 试验菌种
红色毛癣菌10株;石膏样毛癣菌10株;质量控制菌株为近平滑念珠菌1株。本试验所采用的菌株均来自新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)。疣状毛癣菌1株，许兰毛癣菌1株，犬小孢子菌1株，新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科临床检验室提供。
1.3 培养基
RPMI-1640培养基，美国Sigma公司;三氮吗啡琳丙磺酸(MOPS)，美国Sigma公司;沙堡氏琼脂培养基(SDA)，批号20080228，北京奥博星生物科技有限公司。
RPMI-1640培养基的配制：将10.4 g RPMI-1640和34.53 g MOPS粉末溶于900 mL蒸馏水中，用1 mol/L NaOH溶液调整其pH至7.0(25 ℃)，加蒸馏水定容至1 L，G-6漏斗滤过灭菌，存于4 ℃冰箱备用。
SDA培养基的配制：称取PDA 粉末67 g，加入1 000 mL蒸馏水，摇匀加热煮沸溶解，121 ℃高压灭菌20 min，分装，4 ℃保存，备用。
1.4 仪器
BHC-1300ⅡA型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司;FMspx-250B型生化培养箱，上海福玛试验设备有限公司;Leica DM-2500型显微镜，德国。
1.5 地锦草不同部位的提取分离方法
取地锦草全草10 kg，粉碎，加70%乙醇回流提取2次(8、6倍)，每次2 h，药渣加水煎煮提取1次(10倍，2 h)，分别滤过，合并醇提液，减压回收至流浸膏状(相对密度1.1，热测)，另水提液减压回收至流浸膏状(状态同上)。合并以上醇提及水提浸膏(体积约5～10 L，若粘稠可加水稀释)，依次用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，每种有机溶剂萃取5次，合并有机溶剂萃取液，分别将各有机溶剂萃取液及萃取后的水相减压回收至干，分别得到石油醚、氯仿、正丁醇及水相4个溶剂萃取部位，称重，粉碎，即得。
1.6 最低抑菌浓度测定
根据NCCLS推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[4]，测定地锦草不同萃取部位对23株皮肤癣菌的最低抑菌浓度值(MIC)。
1.6.1 抗真菌药物储备液、稀释液的制备 称取地锦草各萃取部位分别为204.8 mg，用1 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成浓度为204 800 μg/mL的储备液，存于-20 ℃冰箱备用;称取TBF 8 mg，用1 mL DMSO溶解，制成浓度为8 000 μg/mL的储备液。从中吸取1 μL加RPMI-1640培养基499 μL，使之稀释500倍，此时，TBF储存液浓度为16 μg/mL，存于-20 ℃冰箱备用。
将地锦草各萃取部位储备液、TBF储备液分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍终浓度。地锦草的2倍终浓度由高到低依次为：2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL;TBF的2倍终浓度由高到低依次为：0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25、0.000 625、0.000 312 5 μg/mL。
1.6.2 菌接种液的制备 ①皮肤癣菌：将受试的皮肤癣菌接种于SDA上，26 ℃培养7～14 d。吸取2 mL无菌的0.85%NaCl溶液，冲洗菌落表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至0.4×106～5×106 cfu/mL之间，用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。②念珠菌：将受试的念珠菌接种于SDA上，36 ℃培养48 h。挑取菌落，加入2 mL无菌的0.85% NaCl溶液中，用0.5# McFarland standard比浊管比浊，用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。
1.6.3 接种 将100 μL的2倍终浓度的药液，由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中，第11孔为生长对照孔(仅加菌悬液100 μL和RPMI-1640培养基100 μL，不加药物)，第12孔为空白对照孔(真菌、药物都不加，只加RPMI-1640培养基200 μL)。将调好的菌接种液100 μL，分别加入相应的微孔内，这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)分别被1∶1稀释到终浓度。
1.6.4 结果判定 皮肤癣菌，26 ℃孵育7～14 d读结果。念珠菌，36 ℃孵育48 h读结果。读取MIC值时，应在不搅动的情况下与对照孔按下列标准比较。0：肉眼清晰;1：略模糊(80%受抑制);2：浊度显著减低(50%受抑制);3：浊度轻度减低;4：浊度未减低。本试验药物取1或2为判定终点。
1.6.5 质量控制 按照NCCLS方案，对近平滑念珠菌XYZ 5001进行反复测定，其两性霉素B的MIC值0.5～4.0 μg/mL，氟康唑的MIC值1.0～4.0 μg/mL，5-氟胞嘧啶的MIC值0.12～0.5 μg/mL。
每次试验以此菌株为对照，只有当其MIC值介于其质控范围之内时，方认为试验操作准确可靠。且只有当生长对照孔生长良好，空白对照无生长，其他孔随药物浓度升高，呈现真菌生长梯度受抑制时，方证明试验成功。
2 结果
(见表1)
表1 地锦草不同萃取部位和TBF抗真菌药物敏感性试验结果注：1.地锦草石油醚萃取部位;2.地锦草氯仿萃取部位;3.地锦草
3 讨论
地锦草是维吾尔医常用药材，临床主要用其复方百癣夏塔热(由地锦草、诃子肉、毛诃子肉、司卡摩尼亚酯、芦荟、西青果药材组成)治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病等皮肤疾病[5]。地锦草主要含有黄酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣质及酚酸类等化合物[6]。药理研究表明，地锦草及其复方具有抗菌、抗炎、抗过敏、免疫调节、抗氧化、保肝、止血及解毒等多种作用[7-11]。
本研究通过不同极性溶剂萃取分离的方法将地锦草主要化学组分分成几部分，通过体外药敏试验筛选，验证其不同萃取部位体外抗真菌活性。结果发现，地锦草4个不同萃取部位中，由于分离后的石油醚和氯仿部位在药敏试验中的溶解度甚小，不能很严谨地读出药敏结果，正丁醇及水部位对皮肤癣菌有明显的抑制作用，其强度正丁醇部位&>水部位。本研究将中药化学提取分离手段与药理试验密切结合，方法快捷、简捷，结果可靠，初步完成了地锦草不同部位的分离与体外药敏检测，为进一步研究其抗真菌有效单体及作用机制奠定了基础。
参考文献
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