作者：何冬梅，尤昭玲，赖毛华，刘慧萍，雷磊，卢芳国
【摘要】 目的 观察寿胎丸对反复自然流产小鼠母胎界面CD4+ T细胞STAT信号转导途径的影响。方法 采用CBA/J×BALB/C建立正常妊娠小鼠模型，CBA/J×DBA/2建立反复自然流产小鼠模型。流产模型小鼠随机分为对照组及寿胎丸组，给药14 d后取其蜕膜和胎盘组织，分离CD4+ T细胞，Springbio720点抗体芯片检测STAT信号转导途径蛋白磷酸化水平。结果 寿胎丸可上调STAT信号转导途径的STAT3和STAT6蛋白的磷酸化水平，同时下调STAT1蛋白的磷酸化水平。结论 STAT3和STAT6信号转导途径的激活可能是寿胎丸治疗反复自然流产的重要分子机制之一。
【关键词】 寿胎丸;反复自然流产;信号转导;小鼠
Abstract：Objective To study the effects of Shoutaiwan on the STAT signal transduction pathway of CD4+ T cells in maternal-fetal interface of mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). Methods CBA/J×BALB/C mating combination and CBA/J×DBA/2 mating combination were used as normal pregnancy and RSA model respectively. Mice with RSA were randomly assigned to model group and Shoutaiwan group. After 14 days of administration， the STAT signal transduction pathway of CD4+ T cells in mice decidual and placental tissues were detected by Springbio 720 antibody microarrays. Results Shoutaiwan could increase the phosphorylation level of STAT3 and STAT6 protein in the STAT signal transduction pathway. At the same time， Shoutaiwan could decrease the phosphorylation level of STAT1 protein. Conclusion The activation of STAT3 and STAT6 signal transduction pathway might play a important role in the therapy of RSA by Shoutaiwan.
Key words：Shoutaiwan;recurrent spontaneous abortion;signal transduction;mice
寿胎丸源自清代名医张锡纯的《医学衷中参西录》，是治疗反复自然流产(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)的有效中药复方[1-2]，但其作用机制尚未得到证实。研究表明，寿胎丸可能通过调节小鼠母胎界面细胞因子信号转导负调控因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)-3蛋白的表达而降低流产的发生[3]，而SOCS3蛋白的表达与细胞内信号级联及转录调控因子的活化具有密切关系，各种刺激物可通过各种信号转导途径诱导SOCS3的表达。信号转导子和转录激活子(Signal transducers and activators of transcription， STAT)信号通路可被细胞因子和生长因子激活，是与细胞生长、增殖和分化关系十分密切的一条细胞信号通路[4]。本研究拟通过观察寿胎丸对RSA小鼠JAK/STAT信号转导途径的影响，探讨寿胎丸治疗RSA的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 药物
寿胎丸由菟丝子、续断、桑寄生和阿胶4味中药组成，将前3味药按1∶1∶1比例混和，置圆底烧瓶中，加10倍量水，
加热回流提取2 h，提取液过滤，残渣加10倍量水继续加热回流提取2 h，提取液过滤，合并两次滤液，阿胶烊化于滤液中，浓缩至含原药材量1 g/mL，4 ℃保存备用。
1.2 动物
健康SPF级8周龄雌性CBA/J小鼠30只，雄性DBA/2小鼠10只，BALB/c小鼠5只，中国医学科学院实验动物研究所提供。
1.3 试剂
RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司);EasySep?正选小鼠CD4试剂盒(加拿大StemCell公司);Springbio 720点抗体芯片磷酸化检测试剂盒(美国Springbio公司)。
1.4 动物模型的建立
将雌性CBA/J与雄性BALB/c小鼠按2∶1比例合笼交配建立正常妊娠小鼠模型，雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合笼交配建立RSA小鼠模型，检出阴栓者计为妊娠第0天。
1.5 分组及给药
将RSA模型小鼠分为RSA模型对照组及寿胎丸组，各组从妊娠第0日开始灌胃给药。剂量根据成人70 kg临床用药剂量按动物体表面积换算，灌胃容积均为0.4 mL/20 g。寿胎丸组给药剂量为含原药材量12 g/kg，为临床等效剂量的4倍。正常妊娠组和RSA模型对照组给予相同体积蒸馏水，连续灌胃给药14 d，末次给药1 h后处死小鼠，取其蜕膜和胎盘组织。
1.6 CD4+ T细胞MAPK信号转导途径蛋白磷酸化水平的检测
取孕14 d小鼠蜕膜和胎盘组织，剪碎，筛网研磨，得单个细胞悬液，通过小鼠淋巴细胞分离液得混合淋巴细胞，混合淋巴细胞用EasySep?正选小鼠CD4试剂盒分离得CD4+ T细胞。收集细胞，加入RIPA裂解液，冰浴裂解30 min，4 ℃下12 000 g离心20 min，取上清，按BCA蛋白浓度测定试剂盒提供的方法测定上清液总蛋白浓度。将芯片与封闭缓冲液在室温条件下封闭30 min，经短暂干燥，置于潮湿的杂交室中。每0.1 mg蛋白样品中加0.014 3 mg Biotin标记试剂，spin柱纯化后，加杂交缓冲液至总体积0.1 mL，上样到封闭好的芯片中，室温下孵育杂交2 h，使用冲洗缓冲液冲洗干净后加入800～1 000 μL生物素标记磷酸化抗体Streptavidin溶液，室温孵育45 min，使用冲洗缓冲液冲洗干净后加入1 000 μL Cy3标记的抗-Streptavidin抗体，室温孵育45 min，使用冲洗缓冲液冲洗干净后再用去离子水冲洗，确保无盐的残渣留在芯片表面。
1.7 图像扫描分析
使用Genepix 4000B进行图像扫描，使用532 nm激发，测定实验样品各点的信号强度。使用软件Genepix Pro 6.0分析数据，以1.5倍作为上调、0.667倍作为下调的标准。
2 结果(见表1、图1)
与RSA模型组比较，寿胎丸可显著上调STAT3和STAT6蛋白的磷酸化水平(≥1.5)，且与正常妊娠组无显著差别。此外，寿胎丸可显著下调STAT1蛋白的磷酸化水平(≤0.667，&>0)。表1 胎丸对CD4+T细胞中STAT信号转导途径的影响注：1号为RSA组，2号为正常妊娠组，3号为寿胎丸组，★上调1.5倍，
3 讨论
STAT信号转导途径是传导细胞因子刺激信号的基本途径之一，能将信号传递到细胞核内，调节特定基因的表达，共包括7个家族成员，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6[4]。研究表明，SOCS3蛋白可经多条STAT信号通路被诱导。Kovarik等[5]研究了IFN-γ处理后的18种人恶性黑色素瘤细胞株中SOCS3的诱导与STAT1磷酸化之间的关系，结果表明，在大多数情况下SOCS3的表达伴随STAT1的磷酸化。然而在一些细胞株中，STAT1的磷酸化并未诱导SOCS3的表达，而在极少数表达SOCS3的细胞株中并未检测到STAT1的磷酸化，由此推测，STAT1并非是SOCS3表达的唯一诱导者。巨噬细胞中IL-6和IL-10可通过STAT3的活化而诱导SOCS3的表达，且SOCS3的表达优先抑制IL-6介导的信号途径[6]。Egwuagu等[7]研究表明，当存在IL-4时Th细胞可被激活并分化为Th3细胞，同时其STAT6信号转导途径被激活，伴随SOCS3蛋白表达的升高。Takatori等[8]研究发现，STAT5a可通过诱导SOCS3表达来阻止IL-12诱导Th1细胞分化而促使Th1/Th3平衡偏向Th3型。
本研究通过Springbio720点抗体芯片，分别检测了RSA组、正常妊娠组和寿胎丸组小鼠母胎界面CD4+ T细胞STAT蛋白磷酸化水平。研究结果表明，寿胎丸可活化STAT信号通路的STAT3和STAT6信号转导途径，对STAT1信号转导途径则表现为抑制作用，而对STAT5a和STAT5b信号转导途径则未表现明显影响。IFN-γ是调节Th1极化持续性的关键细胞因子[9]，IFN-γ经STAT1依赖途径诱导SOCS1，SOCS1的上调被认为是Th1细胞和Th3细胞相互抑制的机制，当Th细胞外的IFN-γ水平很高时，通过STAT6的IL-4诱导信号被SOCS1阻断，Th细胞往Th1方向分化，而当IL-4的水平很高时，通过STAT1的IFN-γ诱导信号被SOCS1阻断，Th细胞往Th3方向分化[10]。因此，推测RSA小鼠母胎界面CD4+T细胞STAT1蛋白磷酸化水平的降低可能与其细胞外IL-4水平升高及IFN-γ水平降低有关。由于Springbio720点抗体芯片不含有STAT2和STAT4蛋白，本次试验未能直接检测STAT2和STAT4蛋白的磷酸化水平，因此，寿胎丸是否通过STAT2信号转导途径的活化而上调SOCS3蛋白的表达尚有待证实。对于STAT4信号转导途径，由于寿胎丸可升高RSA小鼠母胎界面IL-4水平[12]，而IL-4可直接诱导STAT4的活化而促进Th细胞往Th3方向分化[7]，因此，推测寿胎丸可以通过升高IL-4水平而诱导STAT4活化。
综上所述，在STAT信号转导途径中，寿胎丸可能主要通过直接或间接激活STAT3、STAT4和STAT6信号转导途径，促进SOCS3蛋白表达上调，而SOCS3蛋白表达的上调在抑制Th细胞往Th1方向分化的同时可促进Th细胞往Th3方向分化[7]，使RSA小鼠母胎界面的免疫反应由Th1型偏向Th3型，从而改善RSA的妊娠结局。
参考文献
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[8] Takatori H， Nakajima H， Kagami S， et al. Stat5a Inhibits IL-12- induced Th1 cell differentiation through the induction of suppressor of cytokine signaling 3 expression[J]. J Immunol，2005， 174(7)：4105-4112.
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