【摘要】 目的 观察脑出血大鼠心肌组织炎性因子及热休克蛋白表达的变化及扶正护脑胶囊的干预作用。方法 动物随机分为假手术组、模型组、扶正护脑组和安宫牛黄组，分别于术后6、24、72 h 3个时相点取材，采用免疫组织化学法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、热休克蛋白70(HSP70)的蛋白表达，通过图像分析，测定IOD值。结果 模型组各时间点TNF-α、HSP70的IOD值均显著升高，扶正护脑组和安宫牛黄组均能明显降低TNF-α的IOD值，升高HSP70的IOD值。结论 炎性因子参与了脑出血诱发心肌损伤的机制，扶正护脑胶囊通过抑制炎性因子表达、增强热休克蛋白表达而减轻心肌损伤。
【关键词】 肿瘤坏死因子-α；热休克蛋白；扶正护脑胶囊；脑出血；动物模型
Key words：TNF-α；HSP70；Fuzheng Hunao capsule；intracerebral hemorrhage；animal model
研究发现，多种心血管疾病与炎症反应有关，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是极具代表性的促炎细胞因子。脑出血后机体处于应激状态，自身内源性保护系统激活，热休克蛋白70(HSP70)作为一种细胞内源性保护蛋白，在防止应激引起的心肌细胞损害方面起着重要作用。本实验通过观察脑出血大鼠心肌组织TNF-α、HSP70表达水平的变化，探讨炎性因子在脑出血诱发心肌损伤中的病理生理机制以及机体内源性的自我保护机制，并通过观察扶正护脑胶囊的干预效果，为脑心综合征的治疗提供一种新的思路。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，河南省医学科学院动物中心提供。
1.2 主要仪器
MetaMorph图像分析软件(美国Univeral Imaging Corporation)；普通光学显微镜(日本Olympus公司)；Spot-
Ⅱ型数码相机(美国Diagnostic公司)；石蜡切片机(德国Leitz wetzlar公司)。
1.3 主要药物与试剂
即用型SABC免疫组化染色试剂盒、TNF-α、HSP70一抗均购自武汉博士德生物工程公司；PBS(0.01 mol/L，pH 7.2～7.4)、枸橼酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)、浓缩型DAB试剂盒和抗体稀释液均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。扶正护脑胶囊系北京中医药大学东直门医院重点实验室中药化学组提供，0.5 g/粒；安宫牛黄丸系北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，3 g/丸。
2 实验方法
2.1 造模
参照文献[1]方法，即选用胶原酶加肝素联合注射建立脑出血动物模型。大鼠术前8 h禁食，不禁水，用0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上。取头皮正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前囟为原点，向右3 mm、向后1 mm、深度5 mm为注射点，即为右侧尾状核，用牙科钻钻孔，微量注射器注射含胶原酶(1 U/μL)和肝素(7 U/μL)的生理盐水1 μL。假手术组注射等量生理盐水。注药后留针5 min，退针缝合头皮。手术动物苏醒后，根据Bederson等[2]的评定方法，筛选造模成功的动物。
2.2 分组及给药
72只动物随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、扶正护脑组(C组)和安宫牛黄组(D组)，每组18只，分别于术后6、24、72 h 3个时相点取材，每个时相点6只动物。从术前11 d开始灌胃，扶正护脑组剂量为1.35 g/(kg·d)，安宫牛黄组剂量为0.27 g/(kg·d)，假手术组和模型组分别予等量的生理盐水。第12 日造模，手术前后疗程2周。
2.3 标本采集及处理
实验动物麻醉后剖腹，迅速摘取活体心脏，从心尖部开始依次取材，分别投入电镜固定液、4%中性甲醛液，剩下的心室部分置于液氮中保存待测。
2.4 心肌组织、肿瘤坏死因子-α和热休克蛋白70蛋白表达的测定
采用SABC法，具体操作步骤严格按说明书操作。
2.5 染色结果判断及IOD值的测定
TNF-α、HSP70免疫反应阳性物质为棕黄色颗粒。在显微镜图像采集系统下，每例切片随机选取4个1 mm2面积的视野，根据着色强度和阳性表达面积(μm2)的综合情况进行比较。采用MetaMorph图像分析软件测定心肌组织阳性颗粒积分光密度(integrated optical density，IOD)值。IOD为所测结构范围内阳性表达颗粒的总面积和平均吸光度值的乘积，它反映所测结构光密度与面积的综合变化。
2.6 统计学方法
所有数据均以x±s表示，用SPSS12.0统计分析软件进行处理。组间比较采用方差分析，多元相关分析采用Pearson分析。
3 结果
3.1 各组不同时间点肿瘤坏死因子-α积分光密度值比较
(见表1)表1 各组大鼠不同时间点TNF-α积分光密度值比较(略)注：与B组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与A组比较，△P&<0.05，
△△P&<0.01；与C组比较，#P&<0.05(下同)
3.2 各组不同时间点热休克蛋白70积分光密度值比较
(见表2)表2 各组大鼠不同时间点HSP70积分光密度值比较(略)
3.3 模型组大鼠心肌组织炎性因子和热休克蛋白阳性表达强度与心肌损伤程度的相关性分析
前期研究结果表明：脑出血大鼠术后6、24、72 h时血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(CTnI)含量较假手术组显著升高，二者含量的高低代表了心肌的损伤程度[3]；因而，三者阳性表达强度与之作相关性分析，以探讨TNF-α在脑心综合征的病理生理机制中的贡献及HSP70抗心肌损伤的作用。TNF-α的IOD值与CTnI含量呈显著正相关，相关系数是0.519， P&<0.05；与CK-MB含量呈正相关，相关系数是0.370，P&>0.05。HSP70的IOD值与CTnI、CK-MB含量呈正相关，相关系数分别是0.432，P&>0.05。
4 讨论
TNF-α主要由激活的巨噬细胞产生，它是一种具有多种生物学效应的细胞因子，不仅可诱导其他炎性介质的释放，还可以促进中性粒细胞(PMN)与内皮细胞的黏附，阻塞缺血区微血管，释放氧自由基损伤心肌细胞，导致易损区心肌细胞死亡。
HSP70是热休克蛋白家族中在应激条件下合成最为迅速、表达丰度最高的蛋白。心肌缺血是常见的应激反应，可以诱导心肌细胞的HSP70表达，HSP70合成的量与心脏保护的程度有关。脑出血后交感神经系统激活、肾素-血管紧张素系统活性增高、血管内皮功能异常、氧化应激反应增强及炎性细胞因子水平的变化等都是合成HSP70的诱导因素。文献报道了在心肌缺血再灌注时，心肌组织TNF-α、HSP70表达水平明显升高[4-5]，而在脑出血诱发的心肌损伤中尚未见有报道。本实验结果表明，模型组脑出血大鼠心肌组织TNF-α、HSP70表达水平较假手术组明显升高。扶正护脑组大鼠心肌组织TNF-α表达水平明显降低，而HSP70表达水平明显升高。相关分析表明，TNF-α的阳性表达强度与心肌损伤程度呈显著正相关；HSP70阳性表达强度与心肌损伤程度呈正相关性，但无统计学意义。实验结果提示，炎性反应参与了脑出血诱发心肌损伤的病理生理过程，同时，机体内源性保护因子参与并阻止炎性因子介导的心肌损伤效应。扶正护脑胶囊通过降低大鼠心肌组织TNF-α表达水平，升高HSP70表达水平，减轻炎性反应，提高机体内源性保护因子水平，保护心肌细胞，从而减轻心肌损伤。
参考文献
1] 许志强，陈曼娥，蒋晓江.脑心综合征动物模型的建立[J].中华老年心脑血管病杂志，2001，3(2)：119－121.
[2] Bederson JB. Rat middle cerebral artery occulsion： evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17：472.
[3] 赵彦青，孙塑伦，高 颖，等.扶正护脑胶囊对脑出血大鼠血清肌钙蛋白和心肌内皮素的影响[J].中国中医基础医学杂志，2006，12(1)：20－21.
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