作者：杨牧祥，于文涛，徐华洲，王晓红
【摘要】 目的 观察咳喘宁对支气管哮喘大鼠肺组织白细胞介素-5(IL-5)mRNA表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、咳喘宁高剂量组(27 g原药材/kg体重)、咳喘宁低剂量组(13.5 g原药材/kg体重)、桂龙咳喘宁对照组(0.41 g/kg体重)，每组8只。除正常组外，以卵蛋白致敏并吸入激发法制备大鼠支气管哮喘模型，各治疗组均从第1次哮喘激发开始(造模第3周)至处死前每日灌胃给药，激发并给药4周后处死大鼠。采用RT-PCR检测IL-5mRNA表达，采用HE染色观察肺和气管病理组织学变化。结果 与正常组比较，模型组大鼠支气管管壁和平滑肌厚度、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数以及肺组织IL-5mRNA表达明显增加(P&<0.01)；与模型组比较，各治疗组均可显著降低支气管管壁和平滑肌厚度、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞数以及IL-5mRNA表达(P&<0.05或者P&<0.01)。结论 咳喘宁可降低肺组织IL-5mRNA的表达，抑制嗜酸性粒细胞在气道的浸润、聚集和活化，减轻哮喘气道炎症。
【关键词】 咳喘宁；支气管哮喘；白细胞介素-5；大鼠
Key words：Kechuanning；bronchial asthma；IL-5；rat
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞和淋巴细胞等多种炎症细胞参与，白细胞介素-5(IL-5)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子介导的慢性气道炎症[1]。咳喘宁为课题组经多年临床观察筛选的效方，为进一步阐明其作用机制，笔者观察了该药对支气管哮喘大鼠肺组织IL-5mRNA表达和病理组织学的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重180～200 g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号：SCXK
1.2 药物
咳喘宁炙麻黄、炒杏仁、紫菀、款冬花、五味子、炙百部、地龙、炙黄芪、太子参、桃仁、丹参等组成，使用前水煎分别浓缩成含量为2.7 g原药材/mL(高剂量组)和1.35 g原材药/mL(低剂量组)的混悬液。桂龙咳喘宁胶囊：山西桂龙医药有限公司生产，批准文号：国药准字Z20053135，批号050706，0.3 g/粒，使用前用生理盐水溶解成浓度为0.041 g/mL的混悬液。
1.3 试剂及仪器
卵蛋白：美国Sigma公司生产；氢氧化铝：天津市化学试剂三厂生产，分析纯；Trizol：Invitrogen公司；DEPC：美国Sigma公司；DNA Marker：TaKaRa公司；RT、PCR反应体系：北京塞百盛基因技术有限公司。主要仪器：美国PE9600型PCR扩增仪、北京六一电泳仪及电泳槽、法国BIO-PROFIF凝胶图像分析系统、北京鼎国紫外透射仪、彩云JWC-201D型超声物化器、TP1020徕卡生物组织自动脱水机、EG1140徕卡石蜡包埋机、RM2050石蜡切片机等。
1.4 分组及给药
动物随机分为正常组、模型组、咳喘宁高剂量组(高剂量组)、咳喘宁低剂量组(低剂量组)、桂龙咳喘宁胶囊对照组(桂龙咳喘宁组)，每组8只。各治疗组均从第1次哮喘激发开始(造模第3周)至处死前每日灌胃给药，剂量见表1，正常组、模型组予0.5%的羧甲基纤维素钠液灌胃，每日1次，连续4周。
1.5 造模
参考文献[2]方法，除正常组外，各组大鼠腹腔内注射10%卵蛋白和10%氢氧化铝混合液1 mL，致敏后第15日用1%卵蛋白喷雾激发大鼠哮喘发作，隔日1次，每次20 min，共激发4周。以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。正常对照组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。
1.6 检测指标及方法
动物麻醉完全后，取右肺中叶，4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，分别做HE染色；取右肺近肺门处约100 mg，放入Eppendorf管，投入液氮罐，采用RT-PCR检测IL-5mRNA表达。
1.6.1 HE染色
光镜下观察HE染色，并参照文献[3]测量大鼠气道壁的面积，并对气管内周长进行标准化。采用NYD1000型图像分析软件测定完整支气管管腔的内周长(Pi)、管壁面积(WA)、支气管平滑肌的面积，用Pi进行标准化，分别以WA/Pi、支气管平滑肌的面积/Pi表示支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度；同时测定每高倍视野(400倍)的EOS、淋巴细胞数。
1.6.2 RT-PCR检测IL-5mRNA表达
1.6.2.1 总RNA的提取
取肺组织50～100 mg，放入匀浆器内，加入适量的Trizol用匀浆器匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状，然后转移至新的离心管中，室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。小心吸取上清液于另一离心管，加入1/5体积的氯仿，震荡混匀后室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。转移上层水相到另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10 min，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min。RNA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和侧面，弃上清，加入75%的乙醇1 mL，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，尽量弃上清，漂洗2～3次RNA沉淀。最后，在无菌工作台中干燥RNA沉淀5～10 min，加入DEPC处理的50 μL双蒸馏水，55～60 ℃温育10 min使RNA充分溶解，取少许溶解的RNA，用TE Buffer稀释后于紫外分光光度计260 nm和280 nm处读取A值，A260/A280＝1.8～2.0间方可使用，总RNA浓度＝A260×稀释倍数×0.04(μg/μL)，用前调整为1 μg/μL。
1.6.2.2 反转录反应
取总RNA 2 μg，加入RT反应体系(含M-MLV Buffer、dNTPs、Oligo dT Primer、M-MLV Rtase、Rnase Inhibitor等)管中，并用DEPC处理水补足到50 μL反应液体积，震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪42 ℃ 60 min (cDNA合成)，94 ℃ 5 min(反转录酶失活)。-20 ℃保存备用。
1.6.2.3 PCR反应
①PCR扩增引物：引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成。IL-5引物序列上游：5'-AGCTGTGTCTG GGCCATTGCTATGG-3’，下游：5'-CATCACGCCAAGGAACTCTTGCAGGC- 3'，扩增片段为436 bp；β-actin引物序列：上游：5'-CGTTG ACATCCGTAAAGAC-3'，下游：5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'，扩增片段为202 bp。②PCR反应体系：50 μL反应体系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上样染料、稳定剂、反应缓冲液、反转录反应产物、上下游引物等。震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪扩增。③PCR反应条件：IL-5：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s， 60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min×30个循环，延伸72 ℃ 10 min；β-actin：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃
1 min×30个循环，延伸72 ℃ 10 min。
1.6.2.4 半定量分析
取每个标本的扩增产物6 μL于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准分子量标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机，应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图像分析系统Bio-1D++分析软件对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。即IL-5的基因表达量＝IL-5基因的密度/β-actin基因的密度。
1.7 统计学方法
采用SPSS11.5软件进行统计处理，统计方法采用方差分析。
2 结果
2.1 各组大鼠支气管-肺病理组织学的观察及定量分析
正常组大鼠肺组织偶见炎细胞浸润，管壁完整，黏膜未见充血水肿，管壁和平滑肌厚度正常；与正常组比较，模型组大鼠可见支气管壁及血管、支气管周围有大量EOS、淋巴细胞等炎性细胞浸润(P&<0.01)，支气管黏膜水肿、增厚，上皮脱落，微血管渗漏，管腔内分泌物增多，基层细胞增生，平滑肌增厚(P&<0.01)，肺泡间隔变宽；与模型组比较，各治疗组EOS、淋巴细胞等炎性细胞浸润明显减少(P&<0.01)，肺组织充血、水肿现象减轻，管壁和平滑肌厚度明显减少(P&<0.01)，肺泡腔较宽，肺泡间隔较窄；高、低剂量组病理组织学指标改善优于桂龙咳喘宁组(P&<0.05或P&<0.01)。见表1。表1 各组大鼠病理组织学指标的比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.01；与桂龙咳喘宁组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01(下同)
2.2 各组大鼠肺组织IL-5mRNA表达量比较
(见表2)表2 各组大鼠肺组织IL-5mRNA表达量的比较(略)
3 讨论
支气管哮喘属于中医“哮病”范畴。中医学认为，本病的发生大多由于宿痰伏肺，每因外感、饮食、情志、劳倦等诱因引触，以致痰阻气道，肺失宣肃，气道痉挛所致。若本病反复发作，日久损伤肺肾，以致肺肾气虚，气虚则推运血行无力，气血瘀滞，因此，肺肾气虚、痰阻血瘀、肺失宣肃为本病的主要病机。本课题组根据多年临床观察，筛选炙麻黄、炒杏仁、紫菀、款冬花、五味子、炙百部、地龙、炙黄芪、太子参、桃仁、丹参、淫羊藿等药物组成咳喘宁方。方中炙麻黄开宣肺气，杏仁降气平喘，二药相合，一升一降，共为宣降肺气、止咳平喘要药。紫菀与款冬花均可润肺降气、化痰止咳，紫菀长于化痰，款冬花功擅止咳，故二药常相须为用，而为化痰止咳的良药。五味子敛肺滋肾，适用于咳喘日久。百部润肺降逆止咳。地龙咸寒入肺，通经活络、止咳平喘。炙黄芪、太子参补益脾肺之气，养阴生津，提高机体免疫力，以复肺脏宣肃之功。桃仁活血化瘀，可祛肺络瘀血，止咳平喘。丹参功擅活血祛瘀，可以增进肺泡毛细血管网的气体弥散，改善血液循环和肺的宣肃功能，使痰液更易排出。淫羊藿补肾纳气，以利肺气之肃降。诸药合用，标本兼治，共奏补气活血祛瘀、化痰止咳平喘之功效。
IL-5主要由Th3细胞、肥大细胞分泌，IL-5受体主要在EOS表达，EOS是IL-5主要的效应细胞。大量证据亦表明，IL-5是气道炎症的关键性调节因子。在哮喘细胞因子网络中，IL-5对EOS的募集、浸润、迁移入呼吸道并对维持炎症反应具有正向调控作用，而募集至气道的EOS又能分泌IL-5，如此恶性循环，导致了气道的慢性炎症。Humbert等[4]证实，当过敏原刺激IL-5阳性小鼠时可引起小鼠肺EOS增多，气道对乙酰胆碱反应性增加并出现气道炎症改变，病理改变与哮喘患者相似；而刺激IL-5基因缺陷小鼠时未出现上述改变，修复IL-5基因后，重现与哮喘类似的病理改变。Matsumono等[5]发现，吸入人重组IL-5后，气道EOS数量明显增加，而用IL-5单抗体处理动物模型则能显著抑制气道组织内EOS增加。EOS在受到趋化后聚集到气道，而IL-5是由于改变了EOS的密度，并促使其释放颗粒蛋白而引起气道损伤。有学者用RT-PCR方法发现哮喘患者支气管黏膜IL-5mRNA表达增高，且与疾病的严重程度呈正相关[4]。此外，Shi等[6]给哮喘患者吸入IL-5能导致患者的EOS增高及气道高反应性。Till等[7]在支气管哮喘患者的外周血与支气管肺泡灌洗液中均发现IL-5与EOS明显增加，两者且呈平衡关系。由此可见，炎症因子IL-5参与了支气管哮喘的发病机制。本研究发现，哮喘模型组肺组织IL-5mRNA表达较正常组明显增高，说明IL-5参与了支气管哮喘的发病及气道炎症；与模型组比较，咳喘宁高、低剂量组肺组织IL-5mRNA的表达明显降低(P&<0.05)，说明咳喘宁可从转录水平降低肺组织IL-5mRNA的表达，抑制EOS在气道的浸润、聚集和活化，从而减轻了哮喘气道炎症。
参考文献
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