作者：陈楠楠，黄世林，向阳，张德杰，张晨，张励
【摘要】 目的 观察光化学疗法(PUVA)诱导人白血病细胞HL-60、K562、NB4凋亡时对Fas表达的影响。方法 人白血病细胞分别与不同浓度补骨脂素(PSO)、接受或不接受长波紫外线(UVA)照射后共同培养，电镜下观察细胞超微结构改变，荧光定量PCR技术检测细胞Fas基因的表达，流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和Fas蛋白的表达，采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果 PUVA处理后的人白血病细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变；PSO、UVA照射及PUVA可使细胞凋亡率增加，可上调白血病细胞Fas在基因、蛋白水平的表达，PUVA的作用显著强于前两者(P&<0.01)。结论 PUVA可诱导人白血病细胞发生凋亡，作用强于PSO及UVA照射。PUVA诱导白血病细胞凋亡的途径之一为上调HL-60细胞Fas基因表达。
【关键词】 光化学疗法；白血病；HL-60细胞；K562细胞；NB4细胞；细胞凋亡；Fas
Key words：PUVA therapy；leukemia；HL-60 cells；K562 cells；NB4 cells；apoptosis；Fas
补骨脂素(psoralen，PSO)具有光敏性质与抗肿瘤活性。本实验以不同浓度加波长为360 nm，不同照射时间的长波紫外线(ultraviolet A，UVA)光照作用于人白血病细胞HL-60、K562、NB4，通过流式细胞仪检测细胞在光化学疗法(PUVA)后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量PCR及流式细胞技术检测Fas在基因、蛋白水平的表达情况，以探讨PUVA法对人白血病细胞诱导凋亡的作用及部分作用途径。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人急性髓细胞白血病(FAB-M2)HL-60细胞、人红白血病细胞K562由大连医科大学惠赠；人急性髓细胞白血病(FAB- M3)NB4细胞为上海血液学研究所陈竺院士惠赠。
1.2 药物及主要试剂
PSO由大连理工大学及本院共同从补骨脂中提取和制备。二甲基亚砜(DMSO)购自北京化工厂，RPMI1640培养液、胎牛血清为Gibco产品，小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品，Trizol为美国GIBCOBRL产品，Fas基因表达试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，鼠抗人Fas(CD95)单克隆抗体为美国CALTAG实验室产品。
1.3 仪器和设备
流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY-10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制，荧光定量PCR仪(DA7600型)购自中山大学达安基因股份有限公司。
1.4 细胞培养
HL-60、K562、NB4细胞分别常规培养于含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培养基(含硫酸庆大霉素0.025 U/mL)中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行连续培养。
1.5 分组
依据紫外线照射时间将实验组分为下列2组：长波紫外线照射0 min组；长波紫外线照射5 min组。
1.6 细胞超微结构观察
收集浓度为5.0×105/mL，经PUVA处理的白血病细胞10 mL，用PBS清洗2次，转入2.0 mL离心管，离心(2 000 r/min)3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 mL，4 ℃冰箱静置2 h以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，水洗、脱水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射电镜下观察。
1.7 光化学疗法24 h后白血病细胞的凋亡情况
取浓度为4.0×105/mL、处于对数生长期的白血病细胞株5 mL，分别加入0、5、10、20、40 μL的PSO，使其在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80 μg/mL，放入石英比色皿中，在GLY-10型光量子血液平衡治疗仪(λ＝360 nm)上以1 J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0、5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h后，收集5.0×105/mL细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100 μL碘化丙啶(PI)染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μL，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。
1.8 光化学疗法24 h后白血病细胞Fas基因表达情况
①总RNA提取，采用Trizol一步法提取mRNA，按照试剂盒说明书操作。②cDNA合成，反应体系包括：5×反转录buffer 4 μL(含Mg2+＝4 mmol/L)，反转录酶(200 U/μL)1 μL，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DEPC水9.7 μL，RNA模板4 μL，总体积20 μL；反应条件：37 ℃ 1 h， 95 ℃ 3 min。③将cDNA进行PCR扩增，反应体系包括：5×定量PCR buffer 10 μL(含Mg2＋＝2 mmol/L)，Taq酶(3 U/μL)1 μL，Fas上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，各自的荧光探针1.0 μL(注：上、下游引物，探针的终浓度均为10 pmol/L)，dNTP 1 μL，ddh3O 30 μL，cDNA模板5 μL，总体积50 μL；同时，将制备的定量模板按照2×108/mL、2×107/mL、2×106/mL、2×105/mL、2×104/mL梯度稀释，加入不同反应管中，在DA7600型荧光PCR仪进行扩增；反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min， 55 ℃ 1 min，共40个循环。④反应结束后用由计算机计算定量结果，再通过换算得出每微克总RNA中Fas的mRNA拷贝数。上、下游引物及探针序列：Forward Primer：5’-GGGCAT CTGGACCCTCCTA-3’；Reverse Primer：5’-GGCATTAACACTTTTGGA CGATAA-3’；Probe：5’-FAM-CTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAG- TAMRA-3’。
1.9 光化学疗法24 h后白血病细胞Fas蛋白表达情况
收集白血病细胞1×106个，PBS洗涤1次后弃上清液，加入FITC-Fas抗体10 μL，避光孵育20 min，加500 μL PBS上机检测Fas蛋白表达，以FITC-IgG1做对照。
1.10 统计学方法
所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验。各种计量资料以x±s表示，采用多因素方差分析；所有统计计算均用SPSS11.5统计软件进行，P&<0.05为差异有统计学意义。
转贴于2 结果
2.1 光化学疗法后细胞超微结构的改变
白血病细胞HL-60、K562、NB4均出现细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，整个细胞可裂解成大小不一凋亡小体。
2.2 光化学疗法诱导白血病细胞凋亡的作用
(见表1～表3)表1 PUVA后24 h HL-60细胞凋亡率(略)注：与0 min组 0 μg/mL比较，*P&<0.01；与0 min组比较，△P&<0.01(下同)表2 PUVA后24 h K562细胞凋亡率(略)3 PUVA后24 h NB4细胞凋亡率(略)
2.3 光化学疗法24 h后白血病细胞Fas基因表达情况
(见表4～表6)表4 PUVA后24 h HL-60细胞Fas mRNA的表达(略)表5 PUVA后24 h K562细胞Fas mRNA的表达(略)表6 PUVA后24 h NB4细胞Fas mRNA的表达(略)
2.4 光化学疗法24 h后白血病细胞Fas蛋白表达情况
(见表7～表9)表7 PUVA后24 h HL-60细胞Fas蛋白表达(略)表8 PUVA后24 h K562细胞Fas蛋白表达(略)表9 PUVA后24 h NB4细胞Fas蛋白表达(略)
3 讨论
PSO的抗肿瘤、抗白血病作用，以及其具有的光敏活性已被人们所认识[1-5]。本院开展了PUVA体外净化自体骨髓移植治疗各类白血病的临床研究，初步结果令人鼓舞。
本实验采用紫外波长为360 nm的GLY-10型光量子血液平衡治疗仪和/或补骨脂中提取的PSO对人白血病细胞HL-60、K562、NB4进行处理，结果从电镜下的细胞超微结构改变和流式细胞仪检测的细胞凋亡率两个方面证实了PUVA对白血病细胞诱导凋亡的作用。
Fas/FasL系统在传递细胞凋亡信号中起着重要作用[6]。结果显示HL-60、K562、NB4细胞Fas的表达下降。当Fas水平下调至低于Fas/FasL途径诱导凋亡的阈值时，凋亡受到抑制，从而导致肿瘤细胞逃避机体免疫系统监视，在体内无限增殖。荧光定量PCR技术检测结果显示，PUVA上调Fas基因的表达，经PUVA作用后，HL-60细胞Fas基因表达拷贝数的数量级由对照组的103上升至106，K562细胞Fas基因表达拷贝数的数量级由对照组的104上升至107，NB4细胞Fas基因表达拷贝数的数量级由对照组的105上升至108，均上调了3个数量级。流式细胞仪检测结果在Fas蛋白质水平上进一步证实上述结果。由此我们认为，PUVA诱导人白血病细胞发生凋亡的作用途径之一是对Fas/FasL系统的调控，通过上调Fas基因而诱导细胞凋亡。
另外，实验结果显示，PSO、UVA及PUVA均有诱导细胞凋亡及上调Fas基因、蛋白表达的作用，但无论从直观角度还是从统计分析结果上看，PUVA的作用要显著强于前两者，再一次证明PSO光敏活性的同时，也反映出中药成分PSO的光敏活性在PUVA对白血病治疗作用中的重要性。
【参考文献】
1] 陈楠楠，黄世林，张德杰.等.补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL-60、K562作用的研究[J].中国中医急症，2007，16(4)：444－446.
[2] 吴少华，张仲海，赵建斌.补骨脂素体内外抗癌活性的实验研究[J].中国中药杂志，1998，23(5)：303－305.
[3] Garneiro LV， Ferreira SR， Chen CL， et al. Psoralen derivatives and longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell line[J]. J Photochem Photobiol B，2004， 76(1/3)：49－53.
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[5] Effect T， Fabry U， Osieka R， et al. Induction of apoptosis， depletion of glutathione， and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro[J]. Anticancer Res， 2001， 21(4A)：2777－2783.
[6] Nagata S， Golstein P. The Fas death factor[J]. Science，1995， 267(5203)：1449－1456.