作者：郑培永 马赞颂 柳涛 邢练军 季光
【摘要】 ：目的 观察降脂颗粒对非酒精性脂肪肝模型大鼠血清瘦素及肝脏瘦素受体mRNA的影响。方法 高脂饲料制备SD大鼠非酒精性脂肪肝模型，随机分为东宝肝泰组、降脂颗粒低剂量组、降脂颗粒中剂量组、降脂颗粒高剂量组和模型对照组。治疗4周后检测相关指标。结果 降脂颗粒能明显降低非酒精性脂肪肝模型大鼠血脂(TG、TC)的水平，降低血清瘦素水平，增加肝脏瘦素受体mRNA的表达。结论 降脂颗粒可以改善瘦素抵抗并增加非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏瘦素受体mRNA的表达。
【关键词】 降脂颗粒 非酒精性脂肪肝 血清瘦素 瘦素受体mRNA 动物模型
Abstract：Objective To investigate the effect of Jiangzhi Granulas on serum leptin and liver leptin receptor mRNA of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) rat. Methods The NAFLD SD rat model was established by high fat diet， then pided into five groups at random：model control group， Dongbaogantai group， Jiangzhi granulas low-dose group， middle-dose group and high-dose group. The relative indexes were detected respectively after 4 weeks’ treatment. Results Jiangzhi granulas can obviously reduce serum lipid (TC， TG)， leptin and increase liver leptin receptor mRNA of NAFLD rat model. Conclusion Jiangzhi granulas can improve leptin resistence and increase liver leptin receptor mRNA of NAFLD rat model.
Key words：Jiangzhi granulas；nonalcoholic fatty liver；serum leptin；leptin receptor mRNA；animal model
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease， NAFLD)是一类与酒精性肝病相似的肝脏组织学改变，但无过量饮酒史的临床病理综合征。大多数学者认为，NAFLD是遗传-环境-代谢应激相关性疾病，通常原发于与胰岛素抵抗相关的超重、肥胖、2型糖尿病和高脂血症等代谢紊乱，是胰岛素抵抗综合征(insulin resistant syndrome，IRS)或代谢综合征(metabolic syndrome，MS)的组成部分。NAFLD目前发病机制尚未完全明确，新近的研究显示，NAFLD常伴有胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和高胰岛素血症，并与机体对瘦素(Leptin)的敏感性降低即瘦素抵抗有关[1]。本实验观察了降脂颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠血清Leptin及肝组织瘦素受体mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 药物
降脂颗粒干膏粉，每1 g相当于8.69 g原药材，上海龙华医院制剂室提供；东宝肝泰片，通化东宝药业股份有限公司，批号050708。
1.2 试剂
胆固醇，购于国药集团化学试剂有限公司；三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)试剂盒购于南京建成工程研究所；血清Leptin ELISA试剂盒购于上海森雄生物科技有限公司；RT-PCR试剂盒
购于上海申能博彩科技有限公司。
1.3 动物
清洁级雄性SD大鼠68只，体重量(180±30)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.4 模型制备
大鼠适应性饲养1周，按体重随机分为造模组60只、空白对照组8只。造模组参照文献[2]给予高脂饲料(88%基础饲料＋10%猪油＋2%胆固醇)，空白组给予普通饲料，自由饮食饮水。于第4、8周各处死1只造模组大鼠做肝脏病理HE染色，以判断造模情况。
1.5 分组及给药
造模组大鼠随机分成模型对照组、东宝肝泰组及降脂颗粒低、中、高剂量组。东宝肝泰组以0.15 g/(kg·d)灌胃，降脂颗粒低、中、高剂量组分别以降脂颗粒干膏粉0.414、0.828、1.656 g/(kg·d)灌胃，空白对照组及模型对照组分别给予等量的0.5%CMC液，共计4周。
1.6 标本采集
以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉(2 mL/kg)，腹主动脉采血，4 ℃静置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存备用。
1.7 检测指标与方法
1.7.1 血清三酰甘油、总胆固醇游离脂肪酸的测定
按照试剂盒说明书进行操作。
1.7.2 血清瘦素测定
按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.7.3 肝脏瘦素受体mRNA测定
取100 mg肝组织，按照TRIZOL Reagent液说明书提取总RNA，然后用紫外分光光度计定量。按照试剂盒说明书进行cDNA的逆转录。总RNA经RT反应后进行PCR扩增，瘦素受体mRNA上游序列：CAGGCAACACTGAA GGGAAGACG， 382 bp下游序列：CATCATCTGTGACTTCCATACGC 822 bp；β-actin上游序列：TGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAG，207 bp；下游序列：TCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAGAG，431 bp。采用AMV 49 μL体系，1st strand cDNA 10X PCR Buffer各5 μL，dNTP 1μL，目的基因正负链各2 μL，β-actin正负链各2 μL，Taq酶1 μL， DEPC h3O 29 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 40 s， 72 ℃ 1 min，30次循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶，上样量10 μL，6X DNA loading buffer 2 μL，电压150 V，电泳35 min，紫外光灯下观察，凝胶分析系统拍照。用密度扫描仪对特异性条带进行密度扫描，测得其灰度值，与相应的β-actin灰度之比表示肝组织瘦素受体mRNA的相对水平。
1.8 统计学方法
计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，用SPSS12.0软件包进行数据统计。
2 结果
(见表1、表2、图1)表1 降脂颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠血清脂质及血清瘦素的影响(略)注：与模型组比较，*P 3 讨论
目前认为，Leptin参与肝脏内糖及脂肪代谢主要是通过调控肝脏磷酸烯醇式丙酮酸梭激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)的基因表达和糖异生的效率，促进肝脏对乳酸的摄取，刺激肝糖原产生，同时通过蛋白激酶A激活肉毒碱脂酰转移酶，影响肝脏的脂肪代谢。Leptin能通过减少摄食(减少约50%)及提高机体能量消耗即加强肝脏脂肪代谢而降低TG。另外，Leptin还干预胰岛素在肝脏中的作用，一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK下调，抑制胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的磷酸化，影响胰岛素受体后信号转导；另一方面，Leptin通过对PEPCK及糖异生的影响，限制TG的合成，利于提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性。另有研究认为，可以激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)减少脂肪沉积，还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基-辅酶A去饱和(stearoyl-CoAdesaturase-1)，使肝脏VLDL生成和脂肪沉积减少[3]。Peterson等[4]对有严重胰岛素抵抗的患有肝脂肪变性的脂肪萎缩病患者进行Leptin治疗后，发现肝脏的胰岛素敏感性增加，肝脏内的TG含量减少约85%，可逆转胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性，提示Leptin在脂肪肝治疗中具有重要作用。
有研究表明，非酒精性脂肪肝患者普遍存在Leptin抵抗，通过上调固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1)基因的表达，使Leptin特异性抑制肝脏脂酰辅酶A去饱合酶-1(stearoyl-CoA desaturase-1 SCD-1)mRNA表达的能力下降[5]，促进了肝内脂质合成，导致脂肪肝的发生发展。Tobe K等[6]在研究血浆Leptin水平与脂肪肝关系的实验中发现，脂肪肝患者血浆Leptin水平明显高于对照组，而且与转氨酶的升高平行，经多元回归分析表明，Leptin是脂肪肝发生的独立危险因素，瘦素水平与BMI、血清TC、低密度脂蛋白(LDL)、TG水平相关。而且，肥胖时Leptin的有效生物学作用明显下降，而胰岛素水平则明显升高，出现胰岛素抵抗。Leptin抵抗可能参与了肝脏脂肪变性的形成[7-8]。
近年有学者研究了Leptin抵抗的机制。Leptin是通过与其受体结合来传递其调节能量代谢的信号，当受体表达异常时，可引起Leptin抵抗。Bartek[9]发现脂肪肝患者血清中的Leptin和游离Leptin受体水平均显著增高，提示Leptin与其受体结合可能存在障碍。肝组织瘦素受体mRNA变异或表达异常，使受体功能下调时，血清中的Leptin不能发挥生理作用，从而产生Leptin抵抗[10]。
我们采用高脂饮食饲喂雄性SD大鼠成功制备NAFLD大鼠模型后，采用ELISA方法测定各组大鼠血清Leptin浓度，结果表明，模型组大鼠血清Leptin浓度显著高于正常对照组。然而，尽管模型组动物体内有很高的Leptin水平，还是发生了脂质代谢紊乱、NAFLD，表明机体对Leptin的作用不敏感或者反应性降低，存在Leptin抵抗。降脂颗粒组及西药东宝肝泰组血清Leptin水平与模型组相比均有不同程度的下降，具有显著的统计学差异。降脂颗粒系龙华医院院内制剂，全方由绞股蓝、虎杖、丹参、茵陈、干荷叶等5味中药组成。方中绞股蓝味甘、苦，性寒，归脾、肺经，功效益气健脾、化痰、清热解毒，为君。虎杖味苦性寒，归肝、胆、肺经，活血定痛、清热利湿、解毒化痰，丹参性微寒，味苦，归心、肝经，具有活血祛瘀止痛的作用，二者相合共为臣，针对本病湿热痰瘀相互胶着的病机，可谓切中要害。茵陈，味苦，性微寒，归脾、胃、肝、胆经，清利湿热、利胆退黄；干荷叶，味苦，性平，归肝、脾、胃经，功能清热解暑、升发清阳、凉血止血，二者相合为佐使药。纵观全方，诸药合用，针对脂肪肝湿热痰瘀互结于肝的病机，合奏清热利湿化痰、活血祛瘀之功。
伴随着血清Leptin水平的下降，脂肪代谢明显得到改善，脂肪肝程度也明显减轻，病理结果证实了这一点，这说明降脂颗粒可以改善NAFLD大鼠体内的Leptin抵抗，增强Leptin的敏感性。RT-PCR方法检测并半定量分析NAFLD大鼠肝脏Leptin受体mRNA的表达，结果表明，模型组大鼠肝组织Leptin受体mRNA表达较正常对照组明显减弱，各用药组大鼠肝组织Leptin受体mRNA表达均较模型组为高，尤以降脂颗粒高剂量组为显著。NAFLD肝组织Leptin受体表达下降的原因未明，目前国内外也尚无NAFLD肝脏Leptin受体表达的直接报道。本实验结果表明，模型组血清游离脂肪酸水平明显上升，肝瘦素受体表达含量显著下降，提示两者之间可能存在一定的相关性，同时，血清Leptin的升高与肝瘦素受体表达的下降，可能与高瘦素血症对肝脏瘦素受体的表达有负反馈调节作用有关[11]。然而，是高瘦素血症引起瘦素受体表达的下降还是瘦素受体表达的下降引起高瘦素血症，目前还不清楚，有待进一步研究。本实验中，NAFLD大鼠经降脂颗粒治疗后，血清Leptin水平显著下降，同时肝脏瘦素受体mRNA表达明显上升，这表明降脂颗粒可以调节瘦素抵抗和肝瘦素受体mRNA的表达。参考文献
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