作者：杨发明 董联玲 曹娟 冀俊虎
【摘要】 ：目的 观察红景天对血管性痴呆大鼠认知功能及海马CA1区Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，探讨红景天的神经保护作用。方法 采用双侧颈总动脉永久结扎法制备前脑缺血致血管性痴呆模型，以Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力；以免疫组化检测大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 造模组与对照组相比，认知能力明显下降(P&<0.01)，Bcl－2、Bax 蛋白表达增加(P&<0.01)；治疗组与模型组相比，认知能力明显改善(P&<0.01)，Bcl-2蛋白表达明显增加(P&<0.01)，Bax蛋白表达明显减少(P&<0.01)。结论 血管性痴呆大鼠给予红景天后，可以通过调节海马Bcl-2及Bax蛋白表达，抑制神经细胞凋亡，保护神经细胞，促进脑功能的恢复，从而改善大鼠学习记忆能力。
【关键词】 红景天 血管性痴呆 认知障碍 大鼠；Bcl-2 Bax
Abstract：Objective To study the effects of Rhodiola herb on behavior and the expression of Bcl-2 and Bax protein in hippocamps of vascular dementia rat induced by chonic cerebral ischemia. And the protective effect of Rhodiola herb was studied. Methods VD model was formed by adopting the permanent occlusion of bilateral carotid arteries in Wistar rats to produce the forebrain ischemia. Cognitive ability of rats were studied with the Morris water maze. The expression of Bcl-2 and Bax protein in the hippocampus were determined with immunohistochemical staining. Results VD model may decrease cognitive ability (P&<0.01)， increase the expression of Bcl-2 and Bax protein in the hippocampus (P&<0.01). Rhodiola herb alleviated cognitive ability significantly (P&<0.01)， increased the expression of Bcl-2 protein (P&<0.01) and reduced the expression of Bax protein (P&<0.01). Conclusion Rhodiola herb can inhibit apoptosis through regulating the expression of Bcl-2 and Bax protein in the hippocampus. Rhodiola herb may improve cognitive ability in Vascular Dementia rats.
Key words：Rhodiola herb；vascular dementia；cognitive functions；rat；Bcl-2；Bax
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由于脑出血性或缺血性引起的智能障碍性综合征，已经成为严重影响人类生活质量的疾病之一。红景天是景天科景天属(Rhodiola)多年生草本植物，具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种药理作用。本研究采用结扎大鼠双侧颈总动脉拟血管性痴呆模型，观察红景天的神经保护作用，以探索红景天对VD的治疗效果，现报道如下。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级成年雄性Wistar大鼠64只，体重(250±20)g，山西省中医药研究所动物中心提供。
1.2 药物及主要试剂
红景天购自山西千鹤药业有限公司，由山西中医研究院制剂室制备为干燥粉末。每1 g粉末相当于原药材4.26 g。红景天粉末10 g溶于80 mL水中，以5 g/(kg·d)的比例给药。尼莫地平购于天津市中央药业有限公司，批号050801，规格20 mg/片，用时研碎，120 mg(6片)溶于81 mL水中，以20 mg/(kg· d)的比例给药。免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物有限公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器
MT_200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统，成都泰盟科技有限公司；image-pro plus图像处理系统6.0，美国Media Cybernetics公司。
2 实验方法
2.1 动物模型制备
参照Etsuko Miyamoto等[1]方法制作慢性脑供血不足模型。术前大鼠禁食12 h，自由饮水，以0.4%的戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔麻醉，仰卧固定手术台上，常规备皮消毒，颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉(CCA)、小心游离迷走神经。模型组用1号丝线结扎双侧颈总动脉远近端，从中间剪断，缝合伤口；假手术组仅分离颈总动脉而不结扎，缝合伤口，放回笼中保温饲养。术中以60 W灯泡照射，以防止低温脑保护作用，保持肛温在39 ℃。所有动物造模后在同等条件下(室温24 ℃左右，相对湿度40%±5%)喂饲普通饲料，自由饮水。术后3 d给予肌肉注射青霉素预防感染。
2.2 分组与给药
缺血组分组前进行一次Morris水迷宫定位航行训练， 以假手术组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，计算每只大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值&>20%定为痴呆鼠。缺血组随机分为模型组8只，西药组8只，中药组8只。另设假手术组8只。术后第3日开始给药，给药体积为1 mL/100 g体重。西药组给与尼莫地平，中药组给与红景天，连续28 d，假手术组、模型组予等量蒸馏水。
2.3 学习记忆能力测定
采用Morris水迷宫实验装置及动态图像采集分析系统，参照文献[2]方法。Morris水迷宫装置为直径120 cm，圆形逃逸平台高23 cm，直径10 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。水温控制在(24±2)℃，室温24 ℃，屋顶和四壁表面光滑整洁，照明设备四周对称。各组均在灌胃4周后进行检测。定位航行试验历时4 d，预先使大鼠自由游泳2 min使其适应环境和人的抓握等相关操作，实验分别从水池4个象限内将大鼠面向池壁放入水中，由计算机记录各种参数。如果大鼠2 min内未找到平台，需将其牵引到平台，停留20 s，这时潜伏期记为2 min。空间搜索试验：在第4日在空间定位航行后撤除平台，然后任选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，由计算机记录各种参数。
2.4 免疫组织化学检测Bcl-2、Bax阳性细胞的表达
各组大鼠在行为测试完毕后行心脏灌注术，以0.4%的戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔麻醉，立即开胸暴露心脏，左心室迅速插管至主动脉，同时剪开右心室，灌注生理盐水，速度先快后慢，直至舌尖、肝脏变白，大鼠四肢僵硬为满意，迅速取脑，立即将脑置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h，取视交叉后4 mm处至小脑前的脑组织，PBS漂洗，经乙醇常规脱水、二甲苯透明后，浸蜡包埋，5 mm厚切片，行免疫组化染色，严格按照说明操作。
2.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，采用ANOVA分析数据，2组均数比较采用t检验，P&<0.05为具有显著性差异。
3 结果
3.1 血管性痴呆大鼠海马Bcl-2、Bax免疫组化结果
(见表1)表1 血管性痴呆大鼠海马Bcl-2、Bax免疫组化结果(略)注：与假手术组比较，#P&<0.01；与模型组比较，*P&<0.05(下同)
表1显示，Bcl-2、Bax免疫阳性细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，即免疫组化染色的阳性表达成分。图像处理目标是通过测量黄色部分的“黄”度来反映相应蛋白的“量”。以image-pro plus 6.0测量OD(density)值来反映阳性蛋白的强度或浓度。结果显示， Bcl-2、Bax在假手术组海马CA1区有少量表达。VD模型组阳性细胞着色增强，数量明显增加，其中Bax变化更为显著， Bcl-2/Bax的比值较假手术组明显降低。治疗组Bcl-2、Bax阳性细胞也有增加，着色增深，尤其Bcl-2变化显著，Bcl-2/Bax的比值较假手术组明显增高。
3.2 红景天对大鼠认知功能的影响
(见表2、表3)表2 各组大鼠逃避潜伏期测试成绩(略)表3 各组大鼠目的象限停留时间、平台区停留时间、有效区停留距离比较(略)
4 讨论
VD是痴呆的常见类型，现代研究认为，大脑特定部位如额叶、颞叶及边缘系统的血管源性损害可能导致痴呆。双侧颈总动脉结扎方法是一种血管性痴呆造模常用方法，可导致大鼠脑长期慢性供血不足，通过氧自由基途径、兴奋性氨基酸毒作用和钙内环境紊乱途径诱导海马神经元凋亡。目前，Morris水迷宫主要应用在学习记忆的神经生物学机制探讨和神经药理(包括中药药理)的研究。与过去的水迷宫及跳台、避暗等检测工具相比，其主要的优点包括：能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平；将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰；操作简便，数据误差较小[2]。本实验结果显示，在大鼠双侧颈总动脉永久结扎后4周时，认知能力均出现下降，治疗组与模型组比较学习记忆能力明显改善，表明红景天可以改善VD大鼠学习记忆的能力。
Bcl-2家族是细胞凋亡机制中重要的调节因子，Bcl-2、Bax是这一家族中重要成员。Bcl-2基因是一种重要的内源性抗凋亡因子，过度表达后可抑制由于氧自由基、兴奋性氨基酸等诱发的神经细胞凋亡[3-4]。Bax为重要促凋亡基因，其诱导凋亡的机制是Bax同源二聚体的形成[5]，Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用则要通过与Bax结合形成异源二聚体来实现[6]。在本实验中，慢性缺血发生后，Bax蛋白表达增加，形成同源二聚体诱导细胞凋亡；由于细胞自身的保护机制，Bcl-2蛋白表达反应性上调，可使部分Bax同源二聚体分离，与Bcl-2蛋白形成异源二聚体发挥抑制凋亡的作用。由于Bcl-2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡两类蛋白的比例决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡，在慢性缺血过程中，促进凋亡的Bax蛋白表达占优势， 从而导致大脑特定部位神经元凋亡，大鼠认知功能障碍。在本实验中VD大鼠造模后4周海马区Bcl-2和Bax免疫阳性细胞数明显增高达高峰，治疗组与模型组相比Bcl-2免疫阳性细胞数明显增多，而Bax 免疫阳性细胞数明显减少，表明VD大鼠在给予红景天后大脑神经元凋亡受到抑制。
本研究提示，红景天可以通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡，从而改善VD大鼠的认知能力，对VD的预防与治疗具有重要意义。
【参考文献】
[1] Etsuko Miyamoto， Hidekazu Tomimoto. Caudoputamen is damaged by hypocapnia during mechanical ventilation in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Stroke，2001，12：2920－2925.
[2] 胡镜清，温泽淮，赖世隆.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报，2000，17(2)：117－120.
[3] Kluck RM， Bossy Wetzel E， Green DR， et al. The release of cytochrome c from mitochondria：aprimary site for Bcl-2 regulation of apoptosis[J]. Science，1997，275(5303)：1132.
[4] Shimizu S， Narita M， Tsujimoto Y. Bcl22 family proteions regulate the release of apoptogenic cytochrome c by themitochondriam channel VDAC[J]. Nature，1999，399(6375)：483.
[5] Jurgensmeier JM， Xie Z， Deveraux Q， et al. Bax directly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(9)：4997.
[6] Zhu Y， Prehn JH， Culmsee C， et al. The beta2-adrenoceptor agonist clenbuterol modulates Bcl-2，Bcl-2 and Bax protein expression following transient forebrain ischemia[J]. Neuroscience，1999， 90(4)：1255.