核酸扩增技术(NAT)在血液HBV DNA筛查中的应用分析

【关键词】核酸扩增技术(NAT) 血液HBV DNA筛查
　　输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA)技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1／6.3万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒ELISA检测的窗口期及检出变异株，发达国家已陆续将其纳入献血者的常规筛查项目，并取得一定的成效。但由于进口 NAT试剂成本很高，取制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，降低血液核酸筛查的成本，笔者尝试将国产NAT试剂应用到血液HBV DNA筛查中，并对在献血者HBV DNA检测中建立一套适合中国国情的筛查检测体系的可行性进行了探讨。
　　1 材料和方法
　　1.1材料
　　RSP-200(瑞士TECAN)及STAR2000全自动上海加样仪(瑞士HAMILTON)，Microlab FAME(瑞士HAMILTON)和DADE Behring全自动酶免分析仪(德国DADE)，KHB-DP1000磁珠分离仪(上海科华)，MJ Opficon2核酸扩增检测仪(美国Biorad)，专用耗材-96Plate，专用耗材-96Tip Comb，核酸提取试剂盒(上海的华)，HBV检测试剂盒，HBV DNA国家标准品(卫生部临检中心，浓度3600IU／ml)， HBsAgELISA国产试剂(上海科华)和进口试剂(美国Abbott)，乙肝两对半试剂(厦门新创)。
　　1.2检测对象
　　2008年8月～2009年12月无偿献血者标本共9239份。NAT筛查的标本用真空EDTA抗凝留取血样5ml，于8h内分离血清。
　　1.3血液的ELISA常规检测
　　所有标本均经乙肝金标试纸条和ALT试纸条筛查合格后，再进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV国产和进口试剂两遍ELISA筛查及梅毒、ALT检测。
　　1.4标本的汇集
　　将采集的5mlEDTA抗凝的全血室温离心3min(3600g)，保存2～4℃冰箱中，待血液标本ELISA常规筛查合格后，应用STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行8人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。
　　1.5标本的浓缩
　　往每个汇集池中加入浓缩液40μl和促沉剂50μl，充分混匀后在Eppendort离心机以4℃离心1小时(25000～26000g)，留底部110μl左右样震荡混匀备用。
　　1.6核酸的提取
　　采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板①～⑥，板①加去抑制剂20μl、浓缩样100μl、裂解液100μl及专用耗材-96Tip Comb，板②加磁珠溶液100μl，板③～⑤分别加洗涤液A、B、C200μl，板⑥加洗况液80μl，然后在KHB-DP1000磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。
　　1.7核酸扩增及检测
　　用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备PCR反应液(HBV PCR反应液A：HBV PCR反应液B：HBV PCR反诮液C：内标=8：6：1：0.2)，往反应管中加15μl PCR反应液及15μl已提取的核酸，置入核酸扩增检测仪上，按程序操作。内标阳性，样本阳性者报阳性。
　　2 结果
　　2.1灵敏度考评
　　将已知浓度的标准品用阴性血清于不同时间配制成不同拷贝数的应用标准液，进行重复核酸提取、扩增及检测，结果见表1。

　　应用Probit概率统计(SAS9.0)计算95％检测限量及可信限范围。本方法检测HBV DNA95％检测限量为98.0IU／ml，可信限范围为[55.8，548]。
　　2.2已知HBV DNA阳性标本检测结果对7份
　　已知HBV DNA阳性的保存标本(经Roche试剂检测阳性)分别取样1200μl离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和100μl直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也HBV DNA阳性6例和5例，检出率分别为85.7％、72.4％。采用随机双盲法混合了7份阳性血清(经单人份检测阴性)，进行混样检没，7例混样中共检出HBV DNA阳性2例，检出为28.6％，见表2。

　　阳性、定量测定无结果
　　2.3检测系统的精密性
　　对68次扩增实验的质控的CT值进行统计分析：计算前20个质控点：均值x-=30.081，SD=1.051，CV=3.49％。除了一次实验失控，CT值．CT值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，其他实验质控艾在x-±2S范围内，见图1。

　　2.4质量控制
　　为监控实验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴性、阳性对照、质控及内标进行监控。阳性质控品用来监测试剂以及实验室环境是否存在污染等可引起假阳性的系统误差及系统错误，以减少假阳性。阳性质控品用来监测试剂及整个实验过程产生假阴性的系统误差及系统性错误，以减少假阴性。内标是相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阳性的偶然误差及个体性错误，以减少标本的假阴性。阴性对照采用科华公司提供的阴性稀释血浆，质控品由科华公司提供(5×104拷贝／ml)，以阴性血浆稀释成150拷贝／ml，随样本一起检测，内标能被扩增出来，阳性对照、质控均能定性检出阳性。
　　2.5 NAT检测结果
　　共对血清学筛查合格血液9239人份计1157个汇集标本进行扩增检测，初检发现HBV DNA阳性汇集标本6个，对所有初检阳性的汇集标本进行复检，结果全部阴性，假阳性率为0.52％，本次实验未检出 HBV DNA阳性标本。从检测阴性谍集标本中随机进行单份检测(1400μl上样浓缩)，共检测234份，亦未检出HBV DNA阳性标本，见表3。

　　*1157个汇集池中有6个汇集池不是按8×150μl方案汇集，其中3个汇集池是4×150μl，另外3个分别是6×150μl、3×150μl、2×150μl。※在进行HBV DNA检测，有1个内标检出失败。

　　3　讨论
　　血液HBV筛查模式的选择取决于该地区HBV的流行率，一般流行率较低的地区如欧洲、美国(&<3％)主要规定对献血员进行HBsAg和抗-HBc两项筛查，而流行率高的地区比如新加坡、台湾，由于献血人群中HBcAb阳性率较高，对血液HBV筛查只检测HBsAg和ALT两项，这两种筛查模式，都能使输血传播HBV的危险性大大降低。但由于HBV“窗口期”、病毒变异、低滴度感染及ELISA试剂灵敏度的原因，ELISA法筛查并不能根本排除病毒存在的危险，研究表明HBsAg阴性、抗-HBc阳性的健康人群中有约10％HBV DNA阳性，抗-HBs和抗-HBc阳性的健康人群中有5％～15％HBV DNA阳性，尽管血清中病毒载量较低。而HBsAg和抗-HBc联合检测也并不能消除HBV“窗口期”造成的漏检，资料显示 HBV感染后最先存在血清中HBV DNA，而就算用灵敏度较高的ELISA试剂检测抗检测抗体也要经过20-30天的窗口期，因此对献血员HBV筛查迫切需要一种更为有效的方法，比如将可直接检测该毒核酸的 NAT技术引入到血液常规筛查中。国外目前所开展的血液核酸筛查都是在ELISA筛查的基础上进行的，本次实验通过对ELISA检测HBsAg阳性标本36份进行HBV DNA检测，检出率61.1％，并对所有HBsAg阳性标本进行两对半检测，结果两对关检测提示具传染性的一些标本未检出HBV DNA阳性，可能是病毒载量低于方法的检测限量，表明在目前情况下应考虑ELISA和NAT检测方法同时检测血液。目前开展血液HBV DNA常规筛查的主要有德国和日本，他们分别采用的是96人份和20人份混合检测方案，多年来筛查HBV阳性率分别是1／108000和1／53976，显然HBV中等浪行地区的HBsAg阴性、HBV DNA阳性检出率较HBV低流行地区要高，调查显示HBV高流行地区的HBsAg阴性、HBV DNA阳性检出较HBV中等流行地区和低流行地区都要高。
　　我国是乙型肝炎的高度流行区，最近两年调查数据显示，人群中HBsAg携带率已上升至10.12％，在这种乙肝高流行区人群中征集健康它全的医疗用血是相当困难的，目前我国血站的血液筛查都是使用 ELISA方法，而我国的抗-HBc阳性率高达60％，对献血员的筛查主要检测HBsAg和ALT两项，由于该方法的灵敏度较低(国产试剂盒灵敏度为0.5-1.0ng／ml)及病毒“窗口期”变异等原因，使得血液筛查存在一定程度的漏检，给临床用血安全带来极大的威胁。NAT技术可直接检测病毒核酸，能缩短“窗品期”和检测病毒变异株，大大降低了HBV的漏检率。
　　血清学检测HBsAg阴性不能排除HBV感染已经成为共识，1978年Hooftingle等首次报告抗-HBc阳性、HBsAg阴性的供血者可导致受血者HBV感染以后，大量文献报道证明了这种现象确实存在，引起输血传播HBV的主要是HBsAg阴性、HBV DNA阳性的献血者，有研究报告在HBV暴露率高达70％～90％的地区，献血员中有7％～19％为HBsAg阴性HBV感染者，而在HBV暴露率低的西方国家如美国约5％，献血员中仅0％～9％为HBsAg阴性HBV感染者。HBsAg阴性HBV感染者的血清病毒一般保持低水平复制，抗原表达量低，HBV DNA通常&<104IU／ml，目前所用ELISA试剂灵敏度难以检出。有研究证明HBsaAg阴性HBV DNA阳性血18％可导致输血后乙肝感染，而已有报道人隐匿性HBV感染者克隆出来的1个到10个病毒颗粒接种到猩猩身上可复制出典型HBV感染临床表现，因此尽快推行血液核酸筛查是避免输血后HBV感染的有效措施。
　　本实验对经过ELISA筛查合格的献血者9239份标本共计1157汇集样进行HBV DNA检测，结果未检出阳性标本，对从阴性谍集标本中随面拆分的234份标本进行单份检测，结果亦未检出HBV DNA阳性标本。原因可能有几个因素；①无尝献血的组织动员工作保证了从低危人群中采血，血源质量高，不仅已实现100％无尝献血，而且定期献血者占献血人数50％以上，占采血量64％，②是严格实施了免疫筛查，两次ELISA检测分别采用国产和灵敏度很高的进口度剂；③是所采用的NAT试剂灵敏度与国际同等水平相比较低，日本红十字会与Roche合作利用TaqMan PCR，建立的全自动血液核酸常规筛查，其报告的HBV DNA灵敏度为30拷贝／ml。本实验对7份已知HBV DNA阳性的标本按浓缩和不浓缩进行检测，检出率分别为85.7％、72.4％，采用随机双盲法混合7份阴性血清进行混样检测，检出率仅为28.6％，用国家标准品进行灵敏度考评，结果HBV DNA95％检测限量为98.01U／ml；④所采用NAT试剂的特异性尚需提高，对9239份样本计1157个汇集样进行检测，初检假阳性率达0.52％。⑤核酸提取效率需进一步提高，对7份已知HBV DNA阳性标本取150μl与阴性血清混样检测，离心浓缩后再提取，其检出率仅为28.6％，而直接取100μl进行提取，其检出率为72.4％，显然离心浓缩病毒的作用并不大。目前国外所采用的NAT技术多为全自动检测系统，在核酸提取过程中加入“离心浓缩”一步，不利于整个检测系统的自动化，而且实验证明离心浓缩病毒的效果并不明显，国产NAT技术在病毒提取方面还有待改进。
　　当前我国HBV感染情况严峻，每年报告乙型肝炎新发病倒数红为50万，为保障血液安全，预防输血感染HBV，应考虑在血液常规筛查中增加HBV DNA检测。国外对血液HBV DNA检测研究探讨较早，积累不少经验，NAT技术较成熟，但由于试剂成本原因难以在国内得到推广应用。建立一套适合中国国情的血液核酸筛查检测体系，特别是HBV DNA检测体系，对我国这样一个乙肝大国尤其重要。近年来虽然许多国内生物技术公司已开发出较成熟的HBV DNA检测产品，如深圳匹基、上海科华等，但这些产品目前只适用于临床诊断，而血液筛查和临床诊断是两个不同的领域，血液筛查对试剂的灵敏度、特异性要求比临床要求高得多。目前国产核酸试剂用于血液HBV DNA筛查尚处于开始阶段，需进一步积累经验，从样吕制备、扩增、检测多方面进行改进，而提高试剂灵敏度及特异性。
参 考 文 献
[1]叶萍.核酸扩增检测技术预防输血传染病的应用现状及研究进展.国外医学·输血及血液学分册，2003，26（5）:399-402.
[2]白坚石.原料血浆混样HCV/HIV-1核酸检测的方法学研究.中国输血杂志，2003，16（3）:309-312.
[3]黄呈辉.核酸扩增检测在血液筛查的初步应用.中华检验医学杂志，2001，24（3）:141-143.
[4]Q.Meng.全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA，HCV RNA和HIV-1RNA.国外医学·输血及血液学分册，2003，26（3）:280-282.
[5]胡兆平.荧光定量PCR技术在血液筛查中的应用及可行性分析.临床输血与检验，2002，4（1）:7-9.