25-(R)-羟化胆固醇对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制分析

作者：高雅娜1 王阳阳1 蔡智慧 高桂艳 史丽华 刘善民

【摘要】目的 研究肝X受体（LXR）激动剂25-（R）-羟化胆固醇对大鼠肝脏缺血再灌注(IR)后炎症反应及损伤的影响，并探讨其机理。方法 将18只Sprague-Dawley大鼠采用钳夹法制备肝脏IR模型，随机分为假手术组、IR组、羟化胆固醇预处理组，检测再灌注4h和8h后检测血清转氨酶以及肝组织髓过氧化物酶(MPO)水平。Wesstern blot方法检测肝组织ABCA1、ABCG1、ICAM-1及iNOS的蛋白表达水平。结果 IR组可见ALT、AST以及MPO水平明显升高，ICAM-1与iNOS的表达增加。与IR组相比，T0预处理使ALT、AST及MPO值明显降低，ICAM-1和iNOS的表达降低，然而ABCA1及ABCG1的表达明显升高。结论 25-（R）-羟化胆固醇引起的肝脏LXR激活可以通过抑制炎症反应，在肝脏IR损伤中发挥保护作用。
【关键词】缺血再灌注 炎症 肝X受体
【Abstract】 Objective To investigate the effect of the liver X receptor(LXR) endogenous ligand， 25-(R)-oxychlesterol， on hepatic inflammation and injury induced by ischemia reperfusion(IR) in rats and explore the mechanism underlying the protective effect. Methods Eighteen Sprague-Dawley rats were randomly pided into three groups(6 rats in each)：a sham—operation group，an ischemia?reperfusion(IR)group，a Oxycholeserol-IR group．At 4 and 8 hours after reperfusion， the levels of ALT and AST in serum as well as myeloperoxidase(MPO) in liver tissue were observed．Additionally， Western blotting were performed to assay ABCA1， ABCG1， iNOS and VCAM-1 expression. Results Compared with the sham -operation group， the levels of ALT， AST and MPO increased dramatically in mice of the IR group．IR resulted in increased levels of ALT， AST and MPO. Two pro-inflammatory genes ，iNOS and VCAM-1， were induced by IR. In contast， Oxycholeserol precondition improved lowered the level of ALT， AST and MPO. Furthermore， iNOS and VCAM-1 expression were down-regulated in T0-IR group， whereas the expression of ABCA1 and ABCG1， LXR classical target genes， were up-regulated. Conclusions Through its inhibitory effect on inflammation， hepatic LXR activation by 25-(R)-oxychlesterol plays a protective role for IR injury in the rat liver.
【Key words】Ischemia Reperfusion Inflammation Liver X Receptors
　　肝脏缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，IR)损伤是肝脏缺血再灌注后肝脏功能障碍和结构损伤加重的现象。炎症反应是肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一[1][2]，近来研究表明，肝X受体（Live X Receptor， LXR）除调节细胞内胆固醇平衡外，还可发挥抗炎效应[3][4]。本研究小组于2009年首先发现LXR的外源性配体T090131在IR后抑制肝脏炎症反应进而减轻损伤[5]，而本研究拟通过LXR内源性配体25-（R）-羟化胆固醇来诱导肝内LXR激活，观察其对肝脏IR后炎症反应及损伤情况的影响，研究其对肝脏IR损伤的保护机制，为治疗肝脏IR损伤提供新的作用靶点。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料：生化自动分析仪(购自德国Bayer公司)，兔抗ICAM-1、ABCG1、ABCA1、iNOS、β-actin多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司），辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG (购自北京中杉生物技术公司)。 MPO含量测定试剂盒（购自恒大百盛生物公司）。
　　1.2 动物模型的制备：参照Nauta等的方法制备肝脏缺血再灌注模型[6]。麻醉后，取腹部正中切口入腹显露肝脏，显微血管夹夹闭肝中叶和左叶的肝动脉和门静脉，造成70％肝脏缺血模型。钳夹45 min后，恢复入肝血流，造成肝脏缺血再灌注模型。实验分组：将雄性Sprague—Dawley大鼠(由河北大学实验动物中心提供)随机分为假手术组(6只)、IR组(6只)、羟化胆固醇预处理组(6只)3组。其中羟化胆固醇预处理组于手术前4h给予25-（R）-羟化胆固醇（50 mg/kg）灌胃，而假手术组与IR组则给予等体积溶剂（3%羧甲基纤维素）灌胃。
　　1.3 实验方法：①生物化学检查：抽取大鼠下腔静脉血，分离血浆，测定ALT和AST。②Western blot方法检测蛋白表达：提取肝组织蛋白质，进行SDS-PAGE，转膜封闭后，加入适当浓度的第一抗体和第二抗体后，进行电化学发光(ECL)显色，在使用NIH Image J 1.37软件系统对条带灰度进行扫描，观察ICAM-1、iNOS、ABCG1、ABCA1蛋白的表达情况。④髓过氧化物酶(MPO)含量测定：取部分肝组织制作匀浆，严格按照试剂说明书（恒大百盛生物公司）提供的实验步骤操作。
　　1.4 统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS12.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析及q检验、非参数秩和检验、重复测量设计的方差分析。
　　2 结果
　　2.1 血浆ALT和AST的水平：再灌注8h后，IR组与假手术组相比，可见ALT、AST水平增高(P&<0.01)(表1)。再灌注后8 h，与IR组相比羟化胆固醇预处理组ALT、AST水平降低(P&<0.05)(表1)。
　　2.2 MPO含量：MPO含量可以反映肝脏中白细胞浸润及炎症反应的情况。
在再灌注后8h，IR组与假手术组相比可见MPO水平增加(P&<0.01)(表2)。与IR组相比，羟化胆固醇预处理组MPO有所降低(P&<0.05)(表2)。
　　2.3 ABCA1、ABCG1、ICAM-1和iNOS的表达：ABCA1、ABCG1为LXR经典靶基因，可作为LXR活化的标志，而ICAM-1和iNOS均为肝组织炎症反应的标志。我们利用Western blot方法检测它们在肝中表达的变化。再灌注后4h及8 h后，IR组与假手术组相比可见ICAM-1和iNOS表达增加 ( 图1AB)。再灌注后8 h，与IR组相比，羟化胆固醇预处理组ICAM-1和iNOS的表达水平均有所降低 (图1AB)。与假手术组和IR组相比，羟化胆固醇预处理组中ABCA1、ABCG1的表达明显被上调(图1 CD)。
　　3 讨论
　　随着分子生物学、分子免疫学的深入发展，炎症反应在肝缺血再灌注损伤中的作用越来越受到重视。炎症反应在肝脏缺血阶段即被激活，再灌注后则被显著加剧，炎症反应在肝缺血再灌注损伤发生过程中起着重要的作用。肝缺血再灌注时，炎性细胞因子（如TNFα）大量释放，使ICAM-1等粘附分子上调，促使白细胞在肝组织内粘附、浸润增多。聚集的细胞释放氧自由基、蛋白水解酶及各种促凋亡的细胞因子等直接损伤肝细胞导致组织被破坏。同时，活化的白细胞聚集在肝组织中，又释放大量的炎性介质和细胞因子，吸引更多的中性粒细胞聚集、浸润，加重炎症反应，造成恶性循环[7][8]。在本研究中，病理切片及MPO检表明IR组肝脏中白细胞浸润聚集增多，而羟化胆固醇预处理组中白细胞浸润有所缓解。而且，血中ALT、AST检测表明羟化胆固醇预处理缓解了再灌注引起肝损伤。因此，本研究证实羟化胆固醇可以通过减少白细胞浸润而抑制抗炎反应，减轻肝脏IR损伤。 　　 炎症反应时，粘附分子ICAM-1表达升高以及iNOS催化NO产生均可以促进白细胞浸润聚集[9][10]。核转录因子NF-κB可以调节ICAM-1和 iNOS的表达水平，当NF-κB磷酸化后可以结合在ICAM-1和 iNOS的启动子区域，促进这两种基因的转录[11]。而近来已有报道，核受体LXR激活后正是通过抑制NF-κB的转录活性来发挥抗炎作用[12]。本研究表明，LXR激动剂25-（R）-羟化胆固醇预处理使IR损伤后ICAM-1和 iNOS的表达以及NF-κB的磷酸化水平明显降低，肝脏炎症损伤减轻。
　　肝X受体(Liver X receptor，LXR)属于核受体超家族，可在内源性配体（氧化甾醇）和化学性激动剂（如T0901317）的作用下激活，进而启动ABCA1、ABCG1等靶基因的转录。LXR分为α、β两型，LXRα主要在肝脏、巨噬细胞及小肠等部位高表达，而LXRβ在全身各部位广泛表达。近来许多研究表明，LXR除调节细胞内胆固醇平衡外，还可发挥抗炎效应[6][7]。尽管LXR的抗炎作用业已明确，但其是否在IR后抑制肝脏炎症反应进而减轻损伤，目前报道尚少。本研究利用25-（R）-羟化胆固醇预处理的大鼠缺血再灌注模型，证实了其对IR损伤的保护作用。此外，前述数据显示25-（R）-羟化胆固醇预处理上调了肝脏中LXR经典靶基因ABCA1、ABCG1的表达，这就证明了本研究中25-（R）-羟化胆固醇在的确使LXR激活， 所以我们可以认为25-（R）-羟化胆固醇发挥的保护是LXR依赖性的。
参 考 文 献
[1] Lentsch AB，Kato A，et al. Inflammatory mechanisms and therapeutic strategies for warm hepatic ischemia/reperfusion injury[J]. Hepatology，2000， 32:169-173.
[2] Jaeschke H.Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003; 284: G15-G26.
[3] T?r?csik D，Szanto A，Nagy L. Oxysterol signaling links cholesterol metabolism and inflammation via the liver X receptor in macrophages[J]. Mol Aspects Med， 2009， 30(3):134-52.
[4] Hong C，Tontonoz P.Coordination of inflammation and metabolism by PPAR and LXR nuclear receptors[J]. Curr Opin Genet Dev，2008，18(5):461-7.
[5] 王阳阳，鲁素彩，郭雅卿，田媛，陈雷，赵亚敏， 言红健.肝X受体激动剂对大鼠肝脏再灌注损伤的保护作用及其机制[J].中华肝脏病杂志，2011年3期.
[6] Nauta RJ，Tsimoyiannis E，UribeM，et a1．Oxygen-derived free radicals in hepatic ischemia and reperfusion injury in the rat[J]．SurgGynecol Obstet，l990，171：120—125．
[7] Hamada T，Duarte S，et al. Inducible nitric oxide synthase deficiency impairs matrix metalloproteinase-9 activity and disrupts leukocyte migration in hepatic ischemia/reperfusion injury[J]. Am J Pathol， 2009， 174(6):2265-77.
[8] Fondevila C，Busuttil RW， Kupiec-Weglinski JW. Hepatic ischemia/reperfusion injury-a fresh look[J]. Exp Mol Pathol， 2003， 74(2):86-93.
[9] Hu M，Wang Z，Rao J，Cao Y，et al. Inhibi-tion of inducible nitric oxide synthase worsens liver damage regardless of lipopolysaccharide treatment in small-for-size liver transplantation[J]. Transpl Immunol， 2010， Mar 3.
[10] Menezes GB，Lee WY，Zhou H，et al. Selective down-regulation of neutrophil Mac-1 in endotoxemic hepatic microcirculation via IL-10[J]. J Immunol， 2009，183(11):7557-68.
[11] Cheng O，Ostrowski RP，Liu W，et al. Activation of liver X receptor reduces global ischemic brain injury by reduction of nuclear factor-kappaB. Neuroscience，2010，166(4):1101-9.
[12] Ruetten H， Thiemermann C，Perretti M. Upregulation of ICAM-1 expression on J774.2 macrophages by endotoxin involves activation of NF-kappaB but not protein tyrosine kinase: comparison to induction of iNOS. Mediators Inflamm，1999， 8(2):77-84.