关于PPARγ激动剂对大鼠胰腺缺血再灌注损伤作用及机制

　　　　　　 作者：王明玉 孟凯 李华德

【摘要】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)激动剂吡格列酮在大鼠胰腺缺血再灌注损伤中的作用及机制。方法 建立大鼠胰腺缺血再灌注损伤模型，将40只SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注损伤组(IR组)、吡格列酮预处理组(PGZ组)及吡格列酮+GW9662预处理组(PGZ+GW9662组)，每组10只。再灌注后，取静脉血检测血淀粉酶、脂肪酶水平，取胰腺组织检测核因子κB (NFκB)、Bcl2蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)表达。结果 与S组相比，其余3组血淀粉酶和脂肪酶水平、胰腺组织NFκB活性均明显升高，SOD、Bcl2表达则明显降低(F=21.72～356.76，q=4.37～10.13，P&<0.05);与IR组相比，PGZ组血淀粉酶、脂肪酶水平和胰腺组织NFκB活性均明显降低，SOD、Bcl2表达明显升高(q=3.45～8.72，P&<0.05);而PGZ+GW9662组与IR组相比差异无统计学意义(q=0.16～1.13，P&>0.05);与PGZ组相比，PGZ+GW9662 组血淀粉酶、脂肪酶水平和胰腺组织NFκB活性表达明显增加，SOD、Bcl2表达明显降低(q=3.77～8.98，P&<0.05)。结论 PPARγ激动剂吡格列酮可能是通过PPARγ途径上调SOD的活性、Bcl2表达及下调NFκB表达，对胰腺缺血再灌注损伤起保护作用。
【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体;再灌注损伤;胰腺;吡格列酮
[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of pioglitazonea peroxisome proliferatoractivated receptor γ (PPARγ) activatoron pancreatic ischemiareperfusion injury and its mechanism in the rat. Methods A model of ischemiareperfusion injury (IRI) in pancreas was established in 40 SD rats， which were evenly randomized to four groups as shamoperation group (group A)， ischemiareperfusion group (group B)， pioglitazone group (group C) and pioglitazone+GW9662 group (group D). Serum diastase and lipase levels were determined， the pancreas tissue was removed for NFκB， Bcl2 and SOD detections. Results Compared with group A， the serum levels of diastase， lipase and the activities of NFκB in the other three groups were significantly increased， and the expressions of Bcl2 and SOD decreased (F=21.72-356.76，q=4.37-10.13，P&<0.05); Compared with group B， the diastase， lipase and the activities of NFκB in group C were significantly decreased， and Bcl2 and SOD increased (q=3.45-8.72，P&<0.05); Compared with group C， the diastase， lipase， and the activities of NFκB in group D were significantly increased， and Bcl2 and SOD in group D decreased (q=3.77-8.98，P&<0.05). Conclusion PPARγ activatorpioglitazoneprotects against IRI in pancreas is probably through upregulating Bcl2 and SOD and downregulating NFκB activation.
　　[KEY WORDS] Peroxisome proliferatoractivated receptors; Reperfusion injury; Pancreas; Pioglitazone
　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ) 是由配体激活的核转录因子， 广泛存在于心肌、肝脏等组织器官中，其与配体结合后，在基因转录水平发挥转录调控作用[1，2]。近年来研究显示，PPARγ和缺血性病理损伤的关系密切， PPARγ激动剂预处理对心肌、肝脏及休克时组织器官的缺血再灌注损伤有保护作用[3]。目前，有关PPARγ激动剂在胰腺缺血再灌注损伤中是否有保护作用的研究尚少见报道。本实验通过静脉注射特异性PPARγ激动剂吡格列酮，观察其对大鼠胰腺缺血再灌注损伤保护作用，并探讨其可能的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　健康雄性SD大鼠40只，体质量200～250 g(山东大学实验动物中心);吡格列酮和GW9662(Cayman公司， 美国);抗鼠Bcl2(晶美生物公司)、抗鼠核因子κB(NFκB) P65单克隆抗体(Santa Cruz BioTech公司， 美国);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程技术研究所)、7170A全自动生化分析仪(日立公司，日本)。
　　1.2 胰腺缺血再灌注模型的建立术前实验动物禁食12 h，自由进水，用4 g/L氯胺酮(50 mg/kg)腹腔麻醉。腹正中切口，分离胃脾韧带，结扎脾门血管，夹持脾脏，将胃翻向大鼠右侧，暴露膈肌与左肾动脉之间的腹主动脉，游离腹腔干至脾动脉，用无创动脉夹夹闭脾动脉，造成胰腺体尾缺血模型，30 min后松开动脉夹进行再灌注，时间均为2 h。再灌注完成后心房取血2～3 mL，并迅速切取缺血胰腺组织，将标本置于-75 ℃低温冰箱保存。假手术组以相同的手术方法切开显露腹主动脉干及脾动脉，但不夹闭血管。
　　1.3 动物分组及处理
　　健康SD大鼠40只，按随机数字表法分为4组，每组10只。假手术组 (S组)：术前30 min经股静脉分支缓慢注射生理盐水40 mL/kg;缺血再灌注组(IR组)：断流前30 min经股静脉分支缓慢注射生理盐水40 mL/kg;吡格列酮预处理组(PGZ组)：断流前30 min经股静脉分支缓慢注射吡格列酮1 mg/kg;吡格列酮+GW9662预处理组(PGZ+GW9662组)：断流前30 min经股静脉分支缓慢注射GW96621 mg/kg，5 min后静脉注射吡格列酮1 mg/kg。
　　1.4 检测指标
　　1.4.1 血清淀粉酶、脂肪酶测定 在预定的时间点取心房血，应用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶、脂肪酶水平。
　　1.4.2 胰腺组织NFκB活性及Bcl2水平测定采用Western blot法。将0.05 g胰腺组织在低渗缓冲液中匀浆，分离提纯核蛋白溶液。电泳分离蛋白质，将分离好的PAGE胶转印至硝酸纤维素膜上，再用50 g/L脱脂牛奶封闭1 h，在4 ℃条件下依次用NFκB P65、Bcl2和βactin抗体溶液(1∶1 000)孵育 过夜，再置入含二抗的溶液中继续孵育1 h，最后用碱性磷酸酶标记显色，拍照，凝胶成像分析系统(捷达凝胶成像系统3.3)对所得区带进行扫描，经βactin校正后，比较各组的积分吸光度值。
　　1.4.3 胰腺组织SOD活性测定 采用黄嘌呤氧化酶法，具体操作参照试剂盒说明书进行。
　　1.5 统计学处理
　　实验数据以均数±标准差表示。采用SPSS 12. 0及PPMS 1.5[4]统计软件进行统计，多样本均数间比较用单因素方差分析(OneWay ANOVA)。
　　2 结 果
　　与S组相比，其余3组血淀粉酶和脂肪酶水平、胰腺组织NFκB活性均明显升高，SOD、Bcl2表达明显降低(F=21.72～356.76，q=4.37～10.13，P&<0.05);与IR组相比，PGZ组血淀粉酶、脂肪酶水平和胰腺组织NFκB活性均明显降低，SOD活性、Bcl2表达明均显升高(q=3.45～8.72，P&<0.05);而PGZ+GW9662组与IR组相比差异无显著意义(q=0.16～1.13，P&>0.05);与PGZ组相比，PGZ+GW9662 组血淀粉酶、脂肪酶水平和胰腺组织NFκB活性明显增加，SOD、Bcl2表达明显降低(q=3.77～8.98，P&<0.05)。见表1。表1 各组大鼠相关检测指标比较
　　3 讨 论
　　缺血再灌注损伤是造成胰腺移植后各种并发症的主要原因之一，如移植术后早期胰腺炎[5]、移植胰腺原发无功能、移植术后胰岛细胞功能不良，这些都大大降低胰腺移植的效果。研究表明，缺血再灌注导致胰腺微循环障碍和无复流现象发生[6];引起胰腺组织嗜中性粒细胞(PMNs)浸润、黏附和激活，氧自由基和前炎性细胞因子的释放[7];并激活胰酶，导致胰腺的自我消化，诱发急性胰腺炎[8]。吡格列酮属于噻唑烷二酮(TZD)衍生物，是一种PPARγ特异性激动剂，其激活PPARγ后调控多种基因转录，从而参与脂肪和糖的代谢、单核巨噬细胞激活、炎症反应、肿瘤细胞分化和凋亡等生理病理过程。有研究结果显示，吡格列酮有抗脑、心肌缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡作用[9，10]。GW9662(2chloro5nitrobenzanilide)是一种PPARγ特异性阻断剂，能逆转上述作用[11]。本研究结果显示，吡格列酮能减轻胰腺缺血再灌注损伤，而GW9662 能够阻断吡格列酮的保护作用。提示在胰腺缺血再灌注过程中，吡格列酮可以减轻胰腺缺血再灌注损伤。
　　研究结果显示，缺血再灌注损伤可导致细胞凋亡[12]。Bcl2家族是最主要的细胞凋亡调控基因之一，表达产物Bcl2蛋白是一种跨膜蛋白，在抗凋亡中发挥重要作用，可阻断氧自由基、辐射、缺血低氧、抗肿瘤药物等刺激引起的细胞凋亡[13]。Bcl2家族包括两类基因：一类是抗凋亡基因，如Bcl2;另一类是促凋亡基因，如bax。Bcl2/bax表达产物比值可反映它们在细胞凋亡中的作用，若比值升高，则抑制细胞凋亡;反之，则促进细胞凋亡[14]。本实验结果显示，经吡格列酮预处理后胰腺内Bcl2 蛋白表达增加，而GW9662 则能逆转吡格列酮的上述效应。提示PPARγ激活后通过上调Bcl2而发挥抗凋亡作用。

　　NFκB是一种普遍存在于真核细胞中的转录因子，正常情况下，NFκB与其抑制物IκB结合，存在于静止期细胞的胞浆中。炎症反应时细胞因子信号释放，IκB的激酶(IKK)活化与IκB的两个丝氨酸残基结合，导致IκB失活或表达下调。IκB转移到细胞核并刺激基因的表达，从而导致炎症因子的释放。本实验结果显示，再灌注后NFκB主要位于细胞核中，经吡格列酮处理后细胞核中的NFκB表达明显减少。由此推测，吡格列酮是通过抑制NFκB活性，减少TNFα、ICAM1等炎症递质的释放，从而减轻了再灌注引起的炎症反应。
　　SOD是一类金属酶，广泛存在于不需氧的生物组织，分为CuZnSOD、MnSOD、FeSOD。这三类SOD都能催化超氧自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧，保护细胞免受损伤。SOD活力的高低间接反映了机体消除氧自由基的能力。本实验结果显示，缺血再灌注模型大鼠胰腺组织匀浆SOD活性明显下降，而吡格列酮则可拮抗造模后胰腺组织匀浆中SOD下降，从而对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。
　　本研究证实，吡格列酮对胰腺缺血再灌注损伤具有保护作用，这种保护作用与PPARγ激活密切相关。特异性的PPARγ阻断剂GW9662能逆转吡格列酮的保护作用，单独使用时则加重缺血再灌注损伤。由此可见，PPARγ激活可以减轻胰腺缺血再灌注后引起的损伤，其机制可能与上调Bcl2表达和SOD活性，下调NFκB的表达，减少胰腺细胞凋亡的发生有关，但其具体调控机制还有待进一步研究。

参考文献

　　[1]KERSTEN S， DESVERGNE B， WAHLI W. Roles of PPARs in health and disease[J]. Nature， 2000，405(6785):421424.

　　[2]ESCHER P， BRAISSANT O， BASUMODAK S， et al. Rat PPARs: quantitative analysis in adult rat tissues and regulation in fasting and refeeding [J]. Endocrinology， 2001，142(10):41954202.

　　[3]ARAHATA K. Muscular dystrophy[J]. Neuropathology， 2000，20(Suppl): S2441.

　　[4]周晓彬，纪新强，徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志， 2009，24(1):2932.

　　[5]GEORGE H S， GREGORY G T， MICHAEL G S. Ischemia/reperfusioninduced pancreatitis[J]. Dig Surg， 2000，17(1):314.

　　[6]KUSTERER K， POSCHMANN T， FRIEDEMANN A， et al. Arterial constriction， ischemiareperfusion， and leukocyte adherence in acute pancreatitis[J]. Am J Physiol， 1993，265:G165G171.

　　[7]OBERMAIER R， BENZ S， KORTMANN B， et al. Ischemia/reperfusioninduced pancreatitis in rats: a new model of complete normothermic in situ ischemia of a pancreatic tailsegment [J]. Clin Exp Med， 2001，1(1):5159.

　　[8]SAKORAFAS G H， TSIOTOS G G， SARR M G. Ischemia/reperfusioninduced pancreatitis[J]. Dig Surg， 2000，17(1):314.

　　[9]刘尊敬，杨期东，刘运海. PPARγ激动剂对大鼠缺血再灌注脑组织的保护作用及对PPARγ表达的影响[J]. 中风与神经疾病杂志， 2007，24(2):132135.

　　[10]曹泽玲，叶平，龙超良，等. 吡格列酮对缺血再灌注心肌细胞凋亡影响的实验研究[J]. 中华心血管病杂志， 2005，33(7): 648652.

　　[11]KAMADA N， CALE TY. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage[J]. Transplantation， 1979，28(1):4750.

　　[12]王占坤，孙立江，李旭东. Caspase3抑制剂对肾缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 青岛大学医学院学报， 2008，44(2):139144.

　　[13]MACKEY T J， BORKOWSKI A， AMIN P， et al. Bcl2/bax ratio as a p redictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with prostate cancer[J]. Urology， 1998，52(6):10851090.

　　[14]XIE Z， KOYAMA T， SUZUKI J， et al. Coronary reperfusion following ischemia: different expression of Bcl2 and bax proteins， and cardiomyocyte apoptosis[J]. Jpn Heart J， 2001，42(6):759770.