关于外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察

【摘要】 目的 观察外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘微环境中存活状态。方法 选取健康新西兰大白兔24只，体外培养经基因转染红色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞，待细胞活性状态最佳时，利用显微注射方法将其注入兔腰椎间盘，分别于术后1、7、14、30、60 d手术取出椎间盘，制备病理学切片，在荧光显微镜下观察外源性骨髓间充质干细胞是否散发出红色的荧光及荧光细胞数量。结果 术后1、7、14、30、60 d椎间盘切片在荧光显微镜下均可观察到荧光，术后14 d细胞所散发出的荧光较术后1 d及7 d有所减弱，术后60 d红色荧光无明显变化。术后30、60 d荧光细胞数量较1～14 d有所增加(F=15.171，P&<0.01)。结论 手术后60 d外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘内仍处于存活状态。
【关键词】 间质干细胞;椎间盘;逆行变性
[ABSTRACT] Objective To observe the survival condition of exogenous mesenchymal stem cells (MSC) in microenvironment of intervertebral disc (IVD) of rabbit. Methods Twentyfour healthy New Zealand white rabbits were selected， and the cells were microinjected into rabbit IVD when the MSCs were at the best active state. The IVD was removed on day 1， 7， 14， 30 and 60 after operation， and a pathological section done. To make sure if red fluorescence was erupted by MSC and the number of fluorescyte， an observation was done with fluorescence microscope. Results The red fluorescence could be seen on all IVD sections， the fluorescence on 14th day after injection was weaker than that on 1st and 7th day， and obvious red fluorescence seen on 60th day， the cells were more diffused distribution. The number of fluorescytes was more on 30th and 60th day than that on day1-14 (F=15.171，P&<0.01). Conclusion Exogenous MSCs can still survive in living rabbit IVD 60 days after surgery.
　　[KEY WORDS] Mesenchymal stem cells; Intervertebral disc; Retrograde degeneration
　　椎间盘退变是随着人年龄增长而出现的一种生理性退变过程，随着年龄增长椎间盘在体积、形态、结构、组成及生物力学等方面不断发生变化[1]。椎间盘退变是引发颈肩痛、腰背痛等症状的一个重要因素。而椎间盘退变又可以继发脊柱节段性不稳、滑脱、椎管狭窄、椎间盘突出、椎间盘源性腰背痛等一系列脊柱疾患[2]。目前治疗方法主要是保守治疗和手术治疗，但没有一种可以从根本上逆转或延缓椎间盘退变的方法。骨髓间充质干细胞(MSCs)在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞分化的能力[3]，在体外经合适条件诱导可以转化为成软骨细胞[4]，参与软骨修复与再生。椎间盘内的髓核细胞与关节软骨细胞有很多相似的性质，那么，将MSCs置于活体椎间盘内环境之中，MSCs是否可以存活?本实验旨在观察MSCs在活体兔椎间盘内的生存状态，为进一步探讨MSCs向髓核样细胞分化的趋向性奠定实验基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　3月龄新西兰大白兔24只，雌雄不限，购自山东省农业科学院畜牧兽医研究所。经基因转染红色荧光蛋白标记的兔MSCs，购自广州Cyagen Biosciences 公司。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 MSCs的准备 体外培养兔MSCs，至第三或四代细胞状态、活力最好时进行消化。在细胞培养瓶内加入由体积分数为0.002 5的trypsinEDTA0.3 mL+体积分数为0.003的PBS混合液消化5 min，待细胞全部变为圆形漂浮，加入3 mL培养液终止消化， 1 000 r/min离心4 min，弃上清，加入9 g/L的NaCl溶液混成细胞悬浮液后计数，调整细胞密度至1×109/L，待用。
　　1.2.2 手术注射MSCs 常规术前准备，将新西兰大白兔称质量、麻醉(氯胺酮80 mg/kg+地西泮5 mg/kg)后左侧卧位置于手术操作台上，取腰椎后外侧入路，于右侧髂后上棘上方逐层切开，显露椎旁肌，沿其腹侧钝性分离，显露椎体及椎间盘(L23，L34，L45，L56)，应用29 G微量注射器吸取兔MSCs悬液(1×109/L)25 μL注射入椎间盘髓核内(L34，L45，L56);取同体积9 g/L的NaCl溶液注入L23椎间盘髓核内作为对照。注射针刺入深度为0.3 mm，穿破纤维环到达髓核后能够感觉明显落空感。常规关闭切口。术后给予青霉素100万单位肌注。
　　1.2.3 标本制备及观察 分别于术后1、7、14、30、60 d处死动物，获取L23、L34、L45、L56完整椎间盘;迅速将其置于-20 ℃衡冷切片机，选取椎间盘最大横切面，以3 μm厚度切片;切片后立即置于荧光显微镜下观察是否有荧光存在，观察不同时间段荧光细胞密度、亮度、存在部位并进行对比;显微镜(100倍)下计数每高倍视野下荧光细胞。
　　1.3 统计学处理
　　应用SPSS 13.0及PPMS 1.5[5]统计学软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
　　2 结 果
　　2.1 实验动物一般状况
　　24只兔有3只在术后第2、3天死亡，1只并发截瘫。20只兔顺利进入实验观察，无感染等并发症。切取椎间盘后大体观察正常，纤维环完整，注射部位无炎症反应。
　　2.2 荧光显微镜观察
　　荧光显微镜下观察，术后各时间段椎间盘内均可见红色荧光细胞，均位于髓核内，纤维环中基本无荧光细胞。注射MSCs后第1天，在各个椎间盘冷冻切片中均可见明显的红色荧光，呈均匀分布。术后7 d荧光亮度与1 d时无明显差异。术后14 d，同一观察条件下，红色荧光有所减弱，部分发生淬灭。术后30 d，髓核内满布荧光细胞，且亮度高。术后60 d，髓核内仍然存在荧光细胞，密度无明显减低，荧光明显。术后1、7、14、30、60 d椎间盘内荧光细胞数分别为70.81±18.22、60.24±18.78、56.76±23.02、93.53±26.85、103.53±22.43个，30、60 d的荧光细胞数较1、7、14 d增高，差异有显著性(F=15.171，P&<0.01);其他时间段比较差异无显著性(P&>0.05)。

　　3 讨 论
　　椎间盘是一种特殊的组织，较其他组织器官含氧量低[4]，营养要靠椎间盘上下的软骨终板渗透供给。随年龄增长，椎间盘含水量下降、纤维软骨形成、纤维环破裂、Ⅱ型胶原减少变性，继发组织间压力重新分配，继而功能也发生改变，引发退变及疾病发生[8]。本文实验以增加椎间盘内细胞数量、减缓退变为目的，首先观察外源性MSCs在椎间盘内环境中能否存活。
　　MSCs是一种具有多分化潜能的干细胞，经不同条件诱导，可以转化为成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞等[3]。在体外实验的低氧环境及TGFβ1等因素诱导下， MSCs可以朝着髓核样细胞的方向分化[6]。如果直接将MSCs置于椎间盘自然环境， MSCs是否还可以生存呢?红色荧光蛋白是一种经基因转染技术将活细胞内蛋白进行红色荧光标记的技术[7]，即活细胞的蛋白质在荧光显微镜下显现红色的荧光，广泛用于活细胞的研究与观察。这种荧光随细胞的生长分裂而持续存在，而细胞一旦死亡，荧光便消失。本实验应用显微注射方法将外源性兔MSCs注射到活体兔椎间盘内，于注射干细胞后的不同时间段处死动物获取椎间盘标本行冰冻切片，荧光显微镜下观察荧光细胞是否存在，了解MSCs在椎间盘髓核内是否能够生存，并比较了存活细胞数目。结果显示，术后14 d时椎间盘内红色荧光蛋白的亮度降低、细胞数量有所下降，分析其原因为：一部分外源性MSCs不适应椎间盘内环境，发生了功能下降(蛋白表达下降)，或部分细胞死亡，从而红色荧光变淡，细胞数量减少。而术后30 d时，荧光密度及亮度回复注射初期的水平，分析其原因为经过一段时间后MSCs适应了椎间盘的内环境，存活并分化，术后30 d及60 d的荧光细胞数量较术后1 d时增加也说明了这一点。
　　综上所述，外源性MSCs在活体椎间盘内可以存活。
【参考文献】
　[1]刘勇，胡有谷，宁斌. 人退变椎间盘细胞培养及细胞凋亡的研究[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(3):218219.

　　[2]JILL PG U， SALLY R. Degeneration of the intervertebral disc[J]. Arthritis Res Ther， 2003，5:120130.

　　[3]FRANK L， ACOSTA J R， JEFFREY L， et al. The potential role of mesenchymal stem cell therapy for intervertebral disc degeneration: a critical overview[J]. Neurosurg Focus， 2005，19:16.

　　[4]YAMAMOTO Y， MOCHIDA J， SAKAI D， et al. Upregulation of the viability of nucleus pulposus cells by bone marrowderivedstromal cells: significance of direct celltocell contact in coculture system[J]. Spine， 2004，29:15081514.

　　[5]周晓彬，纪新强，徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志， 2009，24(1):2932.

　　[6]RISBUD M V， ALBERT T J， GUTTAPALLI A， et al. Differentiation of mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposuslike phenotype in vitro: implications for cellbased transplantation therapy[J]. Spine， 2004，29(23):26272632.

　　[7]钟卫红，陈建孟. 珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用 [J]. 中国生物工程杂志， 2005，25(5):1014.