关于Synphilin1寡核苷酸对6羟多巴胺诱导帕金森病大鼠黑质Caspase3表达影响

　　　　　　 作者：张鲲鹏 于永鹏 谢安木

【摘要】 目的 观察Synphilin1寡核苷酸对6羟多巴注(6OHDA)诱导的帕金森病(PD)大鼠黑质Caspase3蛋白表达的影响，从而探讨Synphilin1在帕金森病发病机制中的作用。方法 Wistar大鼠60只随机分成5组，PD组、假手术组、反义组、正义组、错义组，每组12只大鼠。PD组立体定向将6OHDA注入左侧黑质制作PD模型，反义组、正义组及错义组分别立体定向将反义、正义、错义寡核苷酸注入到各组鼠的左侧黑质，然后用与PD模型组相同的方法注入6OHDA，假手术组注入生理盐水作为对照。术后4周取大鼠的术侧中脑黑质，应用免疫组化方法检测Synphilin1及Caspase3阳性细胞的表达。结果 与假手术组比较，PD组Synphilin1、Caspase3 阳性细胞表达显著增加(F=16.6、9.4，q=4.21、6.79，P&<0.05、0.01);与PD组比较，反义组Synphilin1、Caspase3阳性细胞表达显著减少(q=5.43、 4.92，P&<0.01);正义和错义组Synphilin1、Caspase3阳性细胞的表达与PD组比较未见明显差异(q=3.31、3.52，P&>0.05)。结论 Synphilin1 反义寡核苷酸对6OHDA诱导的PD大鼠旋转行为有明显的改善作用，提示Synphilin1反义寡核苷酸对黑质神经元损伤具有保护作用，这种保护作用可能至少部分是通过调节Caspase3 的表达来实现的。
【关键词】 Synphilin1;寡核苷酸类;Caspase3蛋白质;羟多巴胺;帕金森病;大鼠
[ABSTRACT] Objective To observe the effects of Synphilin1 on the expression of Caspase3 in substantia nigra in rat with 6hydroxydopamine (6OHDA)induced Parkinson disease (PD)， and explore the role of Synphilin1 in its nosogenesis. MethodsSixty Wistar rats were evenly randomized to five groups: i.e. sham operation， PD， antisense， sense， and missense. For the PD group: 6OHDA was stereotaxically injected into the left substantia nigra to construct a PD model. For antisense， sense， and missense groups: antisense， sense， and missenseoligonucleotides were stereotaxically injected into the left substantia nigra， respectively， and then 6OHDA was stereotaxically injected into the left substantia nigra with the same method used in the PD group. Those in the shamoperation group were injected with same amount of normal saline as the control. Four weeks after the operation， the rat brains were removed and the expressions of Synphilin1， Caspase3 were detected by immunohistochemistry. ResultsCompared with sham operation group， the expressions of Synphilin1 and Caspase3 significantly increased in PD group (F=16.6，9.4;q=4.21，6.79;P&<0.05，0.01); compared with PD group， the expressions of Synphilin1 and Caspase3 significantly decreased in antisense group (q=5.43，4.92;P&<0.01). The expressions of Synphilin1， Caspase3 in the sense and missense groups had no significant difference compared with PD group (q=3.31，3.52;P&>0.05). Conclusion Synphilin1 antisense oligonucleotides obviously improve circling behavior caused by 6OHDA， indicating Synphilin1 antisense oligonucleotides have a neuroprotective effect against substantia nigra neurons damage. This protection is achieved， at least， by regulating the expression of Caspase3.
　　[KEY WORDS] Synphilin1; Oligonucleotides; Caspase3 protein; Oxidopamine; Parkinson disease; Rats
　　帕金森病(PD)是一种好发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征为黑质纹状体系统多巴胺能神经元进行性变性坏死缺失[1]，而其发病机制目前尚未完全阐明，可能与遗传和环境因素作用[2]、兴奋性神经毒作用、氧化应激、凋亡等多种机制相关。大量研究表明，以上不同因素引起的PD最终都表现为黑质致密部多巴胺能神经元的凋亡，即PD的发病有一条共同的通路——细胞凋亡[3]。Caspase家族是一类重要的细胞凋亡调控者，属于半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase3 是细胞凋亡通路上主要的凋亡蛋白酶之一。以往的研究表明，Caspase3 参与了PD 的发病[4]。1999年，ENGELENDER等[5]发现一个与αsynuclein相互作用的蛋白，命名为Synphilin1。众多研究表明，Synphilin1可能参与了PD 的发病[6，7]。但其参与PD发病的确切机制尚未明了，Synphilin1是否参与细胞凋亡过程，Synphilin1与Caspase3的关系如何，未见相关研究报道。本实验采用PD动物模型，利用Synphilin1反义寡核苷酸阻断Synphilin1的表达后，检测阿朴吗啡(APO)诱导大鼠旋转行为的变化，采用免疫组化法检测大鼠黑质Caspase3的表达，以探讨Synphilin1在帕金森病发病机制中的作用。现将结果报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验动物及分组
　　清洁级健康成年雄性Wistar大鼠60只(青岛实验动物中心提供)，体质量220～250 g，随机分为假手术组、PD组、反义组、正义组、错义组，每组12只大鼠。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 Synphilin1寡核苷酸的设计与合成 参照GenBank 提供的大鼠Synphilin1 mRNA序列设计了跨越Synphilin1 mRNA 翻译起始区和编码区的两条反义寡核苷酸，分别为反义序列1：5′TCAGGGGCTTCCATTATTCT3′，反义序列2：5′GGGATGGTCTTGAGAGAGGT3′，经PCRDESN软件分析两条反义寡核苷酸之间无发夹结构、互补结构。同时，设计相应的正义寡核苷酸和错义寡核苷酸作为对照，序列分别如下。正义：5′AGAATAATGGAAGCCCCTGA3′，错义：5′GAATAAATAAGGCGCCTCAG3′，由武汉博士德公司设计合成。
　　1.2.2 模型的建立 腹腔注射水合氯醛(30 mg/100 g)将大鼠麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上(使双侧耳杆尖端插入外耳道，可听到“咔嚓”声)，并使头部两侧保持在水平位置;门齿勾低于耳杆平面2.4 mm，使前、后囟水平高度相差&<0.4 mm。剪去头顶鼠毛，局部消毒，从前向后切开大鼠头顶正中皮肤，切口长约2.5 cm，分离颅骨表面软组织。参照PAXINOS 等[8]的研究结果，以前囟为坐标原点，确定左侧黑质致密部(SNc)坐标:前囟后4.8 mm，矢状缝左侧1.7 mm，硬脑膜下7.5 mm。PD组左侧黑质以微量注射器注入6OHDA 18 μg(18 μg溶于3 μL含2 g/L的抗坏血酸的生理盐水中)，注射流量为1 μL/min，术毕留针10 min;反义组、正义组、错义组连续2 d分别注入3 μL相应的Synphilin1寡核苷酸，第3 天注入6OHDA 3 μL;假手术组黑质内注入3 μL含2 g/L的抗坏血酸的生理盐水，局部消毒，常规缝合创口。每天腹腔注射10万单位青霉素，连用1周，以预防感染。
　　1.2.3 大鼠行为学的检测 术后2周，于大鼠腹腔注射0.5 mg/kg的APO (溶于无菌注射用水中)以诱导大鼠旋转，每次注射20 min后开始记录旋转情况，共记录30 min，连续检测3 d，以后每5 d检测1次。计算平均转速。
　　1.2.4 免疫组化法(ABC法)定性检测Synphilin1和Caspase3蛋白的表达 术后4周，以质量浓度40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L磷酸缓冲液灌流固定大鼠，断头取全脑，分离出中脑。免疫组化步骤参照辛萍等[9]描述的方法进行操作。4 ℃冰箱过夜， DAB 显色，常规脱水、透明、封片。一抗Synphilin1(1∶4 000，美国CHEMICON公司产品)与Caspase3(1∶100，中国武汉博士德公司产品)。每个标本在高倍镜(200倍) 下观察，随机取5个视野，采用德国KONTRONIBAS 2.0全自动图像分析系统，分别计数Synphilin1、Caspase3阳性细胞数。
　　1.3 统计学处理
　　测定数据以±s表示，采用SPSS 11.5及PPMS 1.5统计学软件[10]对数据进行单因素方差分析及组间SNKq检验。
　　2 结 果
　　2.1 实验动物数量分析
　　纳入研究的大鼠60只，因造模过程中死亡16只，进入结果分析44只，其中假手术组10只，PD组9只，反义组8只，正义组9只，错义组8只。
　　2.2 大鼠旋转行为检测
　　大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)20 min后开始记录，共记录30 min，除假手术组无定向旋转外，PD组、反义组、正义组及错义组平均转速分别为(168±31)、(102±25)、(166±18)、(146±17)r，PD组和反义组比较差异具有显著意义(F=13.1，q=7.95，P&<0.01)。
　　2.3 各组大鼠黑质Synphilin1的表达
　　各组都检测到了Synphilin1的表达，该蛋白表达部位在黑质神经细胞的胞浆。与假手术组比较，PD组大鼠黑质Synphilin1表达量显著增多，两者比较差异有显著性(F=16.6，q=4.21，P&<0.05)。与PD组比较，反义组大鼠黑质Synphilin1表达量显著减少，两者比较差异有显著意义(q=5.43，P&<0.01)，而正义组、错义组大鼠黑质Synphilin1表达量未见明显减少，与模型组比较无统计学意义(q=3.31、3.52，P&>0.05)。见表1。
　　2.4 各组大鼠黑质Caspase3的表达
　　各组都检测到了Caspase3的表达，该蛋白表达部位在黑质神经细胞的胞浆。与假手术组比较，PD组大鼠黑质Caspase3的表达量显著增多，两者比较差异有显著性(F=9.4，q=6.79，P&<0.01);与PD组比较，反义组大鼠黑质Caspase3的表达量显著减少，两者比较差异有显著意义(q=4.92，P&<0.01);而正义组、错义组大鼠黑质Caspase3的表达量未见明显减少，与PD组比较差异无统计学意义(q=0.48，q=0.76，P&>0.05)。见表1。表1 各组大鼠黑质Synphilin1、Caspase3阳性细胞数比较

　　3 讨 论
　　6OHDA 是一种去甲肾上腺素同系物，能通过氧化应激反应损伤抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ 和Ⅳ活性，从而导致细胞变性死亡。1968年UNGERSTEDT[11]首先采用6OHDA制备大白鼠PD动物模型，该模型的某些特点和人类PD相似。研究证实，黑质纹状体系统的损毁程度与APO诱导后大鼠的旋转圈数呈正相关[12]。因此，旋转行为的出现和频率大小，是鉴定模型成功、毁损程度和衡量治疗效果的一个重要指标[13]。本实验结果显示，反义组大鼠平均转速较PD组明显降低，旋转的周径增大，这可能与多巴胺能神经元损伤程度较轻有关。利用Synphilin1反义寡核苷酸抑制6OHDA诱导的PD大鼠黑质Synphilin1蛋白的表达后，黑质TH 表达明显增多也支持这一点[14]。说明Synphilin1反义寡核苷酸对 PD大鼠旋转行为有明显的改善作用，这种改善作用与Synphilin1的表达抑制有关，提示阻断Synphilin1的表达具有神经保护作用。为了进一步探讨该保护作用的机制，在本实验中我们探讨了Synphilin1寡核苷酸对大鼠黑质Caspase3 表达的影响。Caspase3是Caspase家族一类重要的细胞凋亡蛋白酶之一，目前发现的Caspase家族蛋白酶共有14种，在细胞凋亡的执行过程中起关键作用，决定着细胞凋亡的形态改变和生物化学改变。已有研究表明，Caspase 2、 3、 7、10和14在细胞凋亡过程中起主要作用[15]。本研究结果表明，PD组大鼠黑质Synphilin1、Caspase3 表达明显增多，而反义组大鼠黑质Synphilin1、Caspase3 表达却明显减少，与PD组比较差异有显著性(P&<0.01)，正义组和错义组没有见到这种变化。说明反义寡核苷酸对Synphilin1表达的抑制是有效的[7]，阻断Synphilin1表达可以明显降低PD大鼠黑质Caspase3 的表达水平，我们推测这一作用可能与神经保护及大鼠行为学的改善有关。
　　以往研究表明，Synphilin1是与αsynuclein相互作用的蛋白，Synphilin1同αsynuclein在PD的路易体(Lewy Body)中共同存在[16]，Synphilin1的异常聚集具有神经毒性，推测它可能也参与了PD的发病，但其确切机制尚未阐明。本研究结果显示，在大鼠黑质Caspase3 与Synphilin1的表达变化一致，说明Synphilin1与Caspase3 可能存在关联，因此Caspase3 可能参与了Synphilin1致PD 的发病过程。从本实验结果来看，Synphilin1反义寡核苷酸具有神经保护作用，且这种保护作用可能是通过降低Caspase3表达从而抑制细胞凋亡来实现的。
　　总而言之，本研究结果提示，Synphilin1可能在6OHDA诱导的PD大鼠黑质神经元损伤机制中起一定作用，Synphilin1反义寡核苷酸能显著抑制Synphilin1的表达并具有神经保护作用，这种保护作用可能有Caspase3的参与。
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