关于结核分枝杆菌耐砒嗪酰胺pncA基因突变的检测

　　　　　　 作者：徐龙强 于红 孙冰梅 周本杰 张文卿

【摘要】 目的 了解青岛市结核分枝杆菌(MTB)耐砒嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因的突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BacT/ALERT 3D培养系统对25例MTB临床分离株进行常规培养和药敏检测，通过PCR扩增pncA全长基因，DNA序列分析检测pncA基因的突变情况。结果 25株MTB临床分离株有22株扩增出含pncA全基因的序列，进行DNA序列分析表明有6例发生了pncA基因的突变，突变发生在pncA基因29、349、428、533、539、541位的核苷酸，并导致PZA酶氨基酸序列的改变。结论 pncA基因突变是青岛市MTB临床分离株耐PZA的分子机制之一。
【关键词】 分枝杆菌，结核;砒嗪酰胺;抗药性;基因，pncA;序列分析，DNA
[ABSTRACT] Objective To investigate the mutation of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis (MTB) and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)resistance strains in Qingdao area. Methods A routine MTB culture and drug susceptibility were done by BacT/ALERT 3D system in 25 clinical isolates of MTB， the pncA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and its mutation was analyzed by DNA sequencing. Results Of the 25 isolates， 22 strains were positive pncA gene by PCR amplification， and the DNA sequence showed that six mutations occurred in 29，349，428，533，539，541 codon of pncA gene， respectively， which resulted in changes of Pzase Amino acid sequence. Conclusion Mutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in PZAresistance of clinical isolates of MTB.
　　[KEY WORDS] Mycobacterium tuberculosis; Pyrazinamide; Drug resistance; Gene， pncA; Sequence analysis， DNA
　　目前结核病仍是威胁人类健康的三大感染性疾病之一，是仅次于艾滋病的第二大致死性感染性疾病。我国的结核病流行至今仍然严重，属全球22个结核病高负担国家之一，目前全国约有600万例结核病病人，每年约25万人死于结核病，结核病仍然是世界卫生组织和我国重点防治的重大传染性疾病之一[1，2]。砒嗪酰胺(PZA)是尼克酰胺的类似物，属一线的抗结核药物， PZA的体内具体作用机制尚不十分明确，一般认为是由结核分枝杆菌(MTB)的吡嗪酰胺酶(Pzase)将PZA转化成具有活性的吡嗪酸(POA)而发挥作用[3]。研究表明，MTB对PZA耐药主要是由于编码Pzase的基因pncA发生突变所致[4]。本实验应用BacT/ALERT 3D培养系统对MTB临床分离株进行常规培养和药敏检测，PCR扩增pncA全长基因，并通过DNA序列分析检测pncA基因的突变。旨在了解青岛市MTB耐PZA分离株的pncA基因的突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系。
　　1 材料和方法
　　1.1 标本来源
　　2008年6～8月，自青岛市胸科医院诊治的25例肺结核病人中得到MTB临床分离株，其中初治病人22例，复治病人3例;年龄20～76岁，平均51岁;男性20例，女性5例。
　　1.2 主要试剂和仪器
　　MTB标准株H37Rv购自中国药品生物制品鉴定所;BacT/ALERT 3D培养系统：法国梅里埃公司;UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、蛋白酶K、PCR所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR Marker等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA回收纯化试剂盒购自Qiagen公司。
　　1.3 细菌的培养和鉴定
　　细菌培养采用BacT/ALERT 3D培养系统和改良罗氏法，按《结核病诊断细菌学检验规程》进行菌种鉴定为MTB[5]。
　　1.4 PZA梯度药敏试验
　　将标本接种至含有C14棕榈酸的12B培养基， 在培养基内加入定量的PZA，37 ℃培养。MTB在浓度高于50 mg/L的PZA培养基上生长判定为耐药，药敏试验采用了PZA两个药物浓度，低浓度为50 mg/L，高浓度为200 mg/L，同时设对照组。
　　1.5 模板DNA的提取
　　取经BacT/ALERT 3D培养系统培养阳性的增菌液1.5 mL，按细菌基因组DNA抽提试剂盒操作步骤提取细菌DNA，保存于-20 ℃备用。
　　1.6 PCR扩增
　　参照文献[6，7]方法设计引物并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中上游引物pncA1：5′GCTGGTCATGTTCGCGATCG3′，下游引物pncA2：5′GCTTTGCGGCGAGCGCTCCA3′，用于扩增pncA全基因561 bp及上游104 bp、下游56 bp，共长721 bp的DNA片段。PCR反应采用30 μL反应体系，包括ddh3O 17.8 μL，10×buffer缓冲液3 μL，10×dNTP 3 μL，25 mmol/L的MgCl2 1.8 μL，引物P1、 P2各0.3 μL(50 μmol/L)，TaqDNA(5×106 U/L)0.8 μL， DNA模板3 μL。循环条件如下：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR产物于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，荧光紫外线灯下观察结果。
　　1.7 DNA序列分析
　　回收纯化的PCR产物送至上海生工生物公司进行序列测定。
　　2 结 果
　　2.1 BacT/ALERT 3D培养系统检测MTB
　　25株MTB临床分离株经BacT/ALERT 3D培养系统鉴定均为结核分枝杆菌，对PZA敏感5株，耐药20株，其中低耐药11株，高耐药9株。
　　2.2 PCR扩增
　　25株MTB临床分离株有22株扩增出pncA全基因的序列(图1)，其中 PZA敏感株4株， PZA低耐药株9株， PZA高耐药株9株。
　　2.3 DNA序列分析
　　对扩增出pncA全部基因序列的22株MTB进行DNA序列测定，结果表明，6例发生了pncA基因的突变，突变率为27.3%，其中PZA低耐药株有2例， PZA高耐药株有4例，突变分别发生在29、349、428、533、539、541位的核苷酸，且发生了相应的氨基酸的改变。见表1、图2。
　　表1 22株结核分枝杆菌临床分离株pncA基因突变情况(n=22)分离株数量碱基密码子氨基酸药敏结果4无改变无改变无改变敏感1A →C at 29CAG→CCGGln→Pro at 10低度耐药1C →T at 349CTG→TTGLeu→Leu at 117低度耐药12无改变无改变无改变耐药1C →G at 428GCC→GGCAla→Gly at 143高度耐药1C →A at 533GCC→GACAla→Asp at 178高度耐药1T →A at 539GTC→GACVal→Asp at 180高度耐药1G →T at 541GAG→TAGGlu→Stop at 181高度耐药
　　图1 pncA全基因PCR 扩增产物电泳结果
　　①为阴性对照;②为MTB标准株H37Rv阳性对照;③～⑥为阳性标本;⑦为PCR Marker 2000
　　图2 pncA基因29号碱基A→C，遗传密码由CAG→CCG，对应的氨基酸由Gln→Pro
　　3 讨 论
　　目前我国结核病的确诊主要依赖于病原学检查，MTB培养是结核病细菌学检查的金标准。而就MTB的分离培养方法而言，我国主要采用改良罗氏培养法和分枝杆菌快速培养仪器系统法进行检测。BacT/ALERT 3D培养系统利用细菌在生长过程中产生CO2的原理，通过比色计传感器和反射光连续自动监测培养瓶底部的CO2变色指示剂的颜色变化，显示培养瓶内是否有细菌生长[8]。该系统的应用使得MTB的阳性分离率高、报告时间缩短、污染率低、安全可靠、自动化程度高，是一种比较理想的分枝杆菌快速培养的方法，但缺点是所需仪器设备的价格比较昂贵，使其推广应用受到限制。

　近年来，MTB耐药的情况相当严重，因此，对耐药MTB做出快速的鉴定，应用分子生物学检测方法，对耐药基因的位置和基因的突变位点进行准确的定位，就显得尤为重要。DNA序列测定的方法不仅能用于细菌基因突变的检测，而且够确定耐药基因突变的部位与性质，其结果直观可靠，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判定突变的金标准[9]。
　　PZA的杀菌作用于1952年被发现，20世纪80年代将其与利福平和异烟肼联合应用于抗结核治疗，成为治疗结核病的重要一线药物。研究表明，pncA的基因突变造成Pzase活性降低或丧失是MTB产生对PZA耐药的主要机制。pncA的基因突变形式多样，突变位点分散，至今已经证实的突变形式至少有170余种[10～12]，包括上游调控序列的变异、核苷酸插入或缺失、IS6110序列的插入、错义突变、末端突变以及全基因的缺失等形式[13]。pncA全长基因仅561 bp，其编码产物Pzase只有186个氨基酸，因此任何一个氨基酸的改变都可能影响其空间构象，从而影响酶与底物PZA的结合，不能将PZA转化成具有抗菌活性的POA。本研究中我们设计的引物扩增pncA基因共721个碱基， 包含了pncA基因561个碱基及其上游104个碱基、下游56个碱基，因此可视为全基因扩增。
　　本实验对22株MTB临床分离株的pncA基因进行了DNA序列分析，有6株发生了pncA基因突变，均为 PZA耐药株，突变率为27.3%。突变类型主要是点突变，导致的蛋白质改变形式主要是单个氨基酸的取代，其中有1例是插入终止密码子，突变发生在pncA基因29～541位的核苷酸，分布于整个基因上，其与国内外报道较一致[4，14]。说明本地区MTB耐PZA与pncA基因的突变有关，可能是该地区MTB分离株耐PZA的主要分子机制之一。而其余的耐药株未发现有pncA基因突变，提示该地区可能同时还存在有非pncA基因突变的其他PZA的耐药机制。但由于本实验例数较少，尚未发现pncA基因突变的规律，今后工作将扩大标本例数，进一步研究探讨MTB耐PZA的分子机制，建立一种耐药检测新方法， 弥补常规药敏试验的不足，以指导临床治疗。
【

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