关于低分子肝素对COPD模型大鼠MMP9及TIMP1影响

　　　　　　 作者：李斌 佟丽 程兆忠 孙妮娜

【摘要】 目的 观察低分子肝素(LMWH)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型肺组织基质金属蛋白酶9(MMP9)及组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP1)表达的影响，探讨其对COPD可能的干预机制。方法 随机将30只Wistar大鼠分成3组， 每组10只。对照组大鼠正常饲养40 d， 不做任何干预; COPD模型组大鼠用香烟染毒加气管内注入脂多糖法建立COPD模型并给予生理盐水皮下注射， 每天1次; LMWH干预组大鼠造模后给予低分子肝素150 U/kg皮下注射， 每天1次， 治疗40 d。观察3组血气、肺组织病理学改变，采用免疫组织化学法检测肺组织MMP9和TIMP1表达。结果 LMWH干预组大鼠肺组织的病理改变程度减轻， MMP9表达减少， 其阳性面积及MMP9/TIMP1与COPD模型组比较差异有显著意义(F=6.39、56.04，q=26.72、3.34，P&<0.01)。结论 LMWH可能通过调节MMP9、TIMP1表达， 减轻肺气肿时肺泡壁破坏过程中细胞外基质的降解， 发挥治疗COPD的作用。
【关键词】 肺疾病，慢性阻塞性;肝素，低分子量;明胶酶B;组织金属蛋白酶抑制物1
[ABSTRACT] Objective To observe the effects of low molecular heparin (LMH) on expressions of matrix metalloproteinase9 (MMP9) and tissue inhibitors of metalloproteinase1 (TIMP1) in lung tissue of Wistar rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the possible intervention mechanism of this condition. Methods Thirty Wistar rats were equally randomized to control group: normally raised for 40 days without any interference; COPD model group: cigarette inhalation plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide and hypodermic injection of normal saline， once a day; LMH group: LMH， 150 U/kg， hypodermic injection， once a day for 40 days. Blood gas， histology of lung tissue， and MMP9/TIMP1 expressions wereexamined. Results Pathological changes of the lung tissue in LMH decreased， compared with COPD model group， the differences of expression of MMP9 and the ratio of MMP9/TIMP1 were significantly different (F=6.39，56.04;q=26.72，3.34;P&<0.01). Conclusion Low molecular heparin educes its effect on therapy of COPD probably by regulating the expressions of MMP9 and TIMP1， lessening the degradation of extracellular matrix in the process of destruction of extracellular matrix of alveolar wall when emphysema happened.
　　[KEY WORDS] Pulmonary disease， chronic obstructive; Heparin， lowmolecularweight; Gelatinase B; Tissue inhibitors of metalloproteinase1
　　呼吸道细胞外基质重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)不可逆性气流受限的重要病理基础。基质金属蛋白酶(MMP)在细胞外基质破坏中起重要作用。本研究以COPD模型大鼠为研究对象，予低分子肝素(LMWH)干预，观察其血气、肺组织病理学改变及肺组织基质金属蛋白酶9(MMP9)及组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP1)表达，探讨LMWH在治疗COPD方面的作用及其可能的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂及仪器
　　主要药品和试剂: LMWH(法安明， 辉瑞比利时公司)， 脂多糖(LPS，美国Sigma公司)， 兔抗鼠MMP9抗体、兔抗鼠TIMP1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。主要仪器: 有机玻璃熏箱(北京呼吸病研究所)， OLYMPUSCH显微镜及显微照相仪(日本奥林巴斯公司)， VIDAS21型图像处理系统(德国欧波同公司)。
　　1.2 动物分组与处理
　　选择纯系雄性Wistar大鼠30只，鼠龄3个月，体质量200～240 g，由青岛市药检所动物实验中心提供。将动物随机分为3组: ①对照组10只，正常饲养40 d，不做任何干预，作为空白对照;②COPD模型组10只，第1、14天气管内注入LPS 200 μg(200 μL)，第 2～13天、第 15～40天每天上、下午分别将大鼠置于密闭有机玻璃箱内熏将军牌香烟各0.5 h，每次10支香烟，共20支，通过箱侧壁孔使箱内气压与大气压相等，中间间隔4 h，第1～40天给予灭菌生理盐水1 mL皮下注射，每天1次; ③LMWH干预组10只，造模方法同模型组，给予LMWH(剂量为150 U/kg)1 mL皮下注射，每天1次，治疗40 d。
　　1.3 动脉血气分析
　　3组大鼠用100 g/L的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后固定于手术台上，迅速打开腹腔，自腹主动脉抽取0.5 mL动脉血迅速送实验室进行血气分析。
　　1.4 肺组织光镜制片及染色
　　3组大鼠迅速打开胸腔，心脏穿刺放血，解剖暴露出气管， 自肺门处分离肺组织， 取右下肺叶， 置于40 g/L的中性甲醛固定液内固定24 h， 常规梯度乙醇脱水， 浸蜡、包埋、切片， 苏木精伊红染色， 光镜下观察。保留部分切片应用免疫组织化学方法检测肺组织MMP9及TIMP1的表达。光镜下，两者阳性反应为胞浆着色呈棕褐色。取部分切片以0.1 mol/L的PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片在同一放大倍数下随机选取5个视野， 应用多功能彩色图像分析系统对MMP9、TIMP1的表达进行分析， 用相对阳性面积表示表达强度。
　　1.5 统计学方法
　　应用SPSS 11.5及PPMS 1.5[1]统计软件对结果进行统计学分析， 组间比较采用方差分析。
　　2 结 果
　　2.1 动脉血气测定
　　COPD模型组动脉血PaO2低于对照组，PaCO2高于对照组，差异有显著性(F=36.27、43.96，q=11.89、13.11，P&<0.01);LMWH干预组动脉血PaO2和PaCO2与对照组比较差异有显著性(q=7.63、4.83，P&<0.01)，与COPD模型组比较差异亦有显著性(q=4.26，P&<0.05;q=8.28，P&<0.01)。见表1。
　　2.2 肺组织病理学改变
　　对照组大鼠支气管肺组织上皮结构完整，支气管纤毛排列整齐，无杯状细胞明显增生，气管周围无炎细胞浸润; 肺泡结构完整，无扩张融合，无炎症表现，肺泡大小均匀一致。COPD模型组大鼠支气管黏膜纤毛柱状上皮细胞部分脱落，纤毛粘连、倒伏、缺失、变性坏死，杯状细胞增生，黏膜下层及肌层大量炎症细胞浸润，部分支气管平滑肌明显增厚; 管腔内充满大量中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及黏液分泌物; 大部分肺泡扩张融合，肺泡隔明显增厚，肺泡直径增大，其中可见炎性细胞浸润，呈支气管炎、肺气肿的特征性病理学改变。LMWH干预组大鼠支气管肺组织损伤的程度较COPD模型组轻，支气管周围炎症较轻，杯状细胞增生程度降低，肺泡扩张融合较明显，同对照组比较仍有差别。
　　2.3 MMP9、TIMP1的表达
　　COPD模型组MMP9、TIMP1表达增强，二者相对阳性面积及MMP9/TIMP1比值与对照组比较，差异有显著性(F=6.39～56.04，q=11.47～41.34，P&<0.01); LMWH干预组MMP9表达减少，其阳性面积及MMP9/TIMP1与COPD模型组比较差异具有显著意义(q=26.72、3.34，P&<0.01)。与对照组比较，LMWH干预组MMP9、TIMP1表达仍增强，但MMP9/TIMP1与对照组比较差异无显著性。见表2。表1 各组大鼠动脉血气测定结果表2 各组MMP9、TIMP1表达及MMP9/TIMP1比值的比较(±s)组 别n相对阳性面积MMP9TIMP1MMP9/TIMP1对照组
　　3 讨 论
　　肺气肿是COPD主要的病理改变之一，严重时在COPD气流受限的发生、发展中占主导地位[2]。

　　目前认为蛋白酶和抗蛋白酶失衡是肺气肿形成的主要机制之一。MMPs在肺气肿时肺泡壁细胞外基质破坏中起了重要作用。MMP9作为MMPs家族中的明胶酶，可以降解细胞外基质和基底膜多种成分。TIMP1是MMPs的内源性天然抑制因子所有亚类中活性最强的，其特异性抑制MMP9活性。研究表明，COPD病人肺泡巨噬细胞释放大量活性增高的MMP9，诱导痰和肺泡灌洗液中MMP9含量增高[3～5]。MERCER等[6]报道，COPD急性加重期病人痰中MMP9含量及活性增加，TIMP1减少，二者比值增高，且与肺功能下降有相关性。孔英君等[7]研究显示，COPD病人血清MMP9、TIMP1浓度及MMP9/TIMP1比值增加，与气流阻塞呈负相关。李红梅等[8]通过动物实验证实，MMP9、TIMP1 在气道上皮、成纤维细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及部分肺泡壁细胞表达均明显增强，支气管肺组织 MMP9、TIMP1 mRNA表达亦显著增强，MMP9酶活性亦显著增高，并推测MMP/TIMP 失衡是气道重塑的重要机制之一。
　　LMWH由普通肝素酶解或化学降解而得，具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗肿瘤和抑制肾小球系膜细胞及基质增生等作用。目前，国外多项研究发现肝素的抗炎特性区别于其抗凝特性而独立存在。通过体外模拟COPD发病机制中的中性粒细胞释放弹性蛋白酶过程，BROWN等[9]证实，LMWH阻止中性粒细胞的聚集并且抑制其诱导的弹性蛋白酶的表达，从而发挥抗炎等作用。但是，LMWH是否影响在肺气肿时肺泡壁细胞外基质破坏中起了重要作用的MMPs 的表达，国内外尚未见研究报道。
　　本研究通过被动吸烟加气管内注入LPS法建立COPD大鼠模型，动脉血气与COPD的病理生理改变相似，其肺部病理改变符合COPD的变化，表明模型制备成功[10，11]。免疫组化结果显示，COPD 模型组支气管肺组织MMP9、TIMP1 蛋白表达均较对照组显著增强，MMP9上升更显著，MMP9/TIMP1增加; 支气管黏膜下淋巴细胞数和肺泡巨噬细胞数也较对照组显著增多。这表明在香烟染毒及内毒素的作用下，MMP9在结构细胞和炎性细胞中大量生成，使得其降解细胞外基质的作用增强。LMWH干预组损伤减轻，MMP9表达与COPD模型组比较差异有显著性，MMP9/TIMP1比值下降，平衡改善。LMWH干预组MMP9、TIMP1表达与对照组比较仍增强，差异有显著性，但MMP9/TIMP1比值与对照组比较差异无显著性。根据上述结果，我们推测LMWH可能通过调节MMP9和TIMP1 的表达，减轻肺气肿时肺泡壁破坏过程中细胞外基质的降解，从而发挥其治疗COPD的作用。
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