关于Caspase1抑制剂对大鼠急性痛风性关节炎的作用

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　　　　　　作者：谷祖华 苗志敏 李长贵

【摘要】 目的 研究Caspase1抑制剂ACYVADCMK对尿酸钠晶体诱导大鼠急性痛风性关节炎(GA)的作用。方法 选用健康雄性Wistar大鼠50只，按随机区组法将大鼠分为5组：空白对照组(A组)，模型组(B组)，秋水仙碱组(C组)，低剂量ACYVADCMK组(D组)，高剂量ACYVADCMK组(E组)，每组10只。采用尿酸钠晶体制备大鼠 GA模型，造模后给药3 d，A、B组给予生理盐水，C组给予秋水仙碱，D、E组给予不同剂量ACYVADCMK。用皮尺测定造模后2、4、6、8、24、48、72 h大鼠的踝关节周径;造模后72 h，麻醉后心脏取血，生理盐水冲洗关节腔，行白细胞计数;采用放射免疫分析法测定大鼠关节冲洗液及血清中白细胞介素1β(IL1β)的水平;以苏木精伊红染色观察大鼠关节滑膜的病理学改变。结果 造模后72 h，ACYVADCMK能显著降低 GA模型大鼠的踝关节肿胀度及关节冲洗液、血液白细胞水平(F=10.34～44.66，P&<0.01)。放射免疫分析检测结果显示，ACYVADCMK可显著降低GA大鼠关节冲洗液及血清中IL1β的水平(F=4.34、4.49，P&<0.01)。病理组织学检查结果显示，ACYVADCMK可减轻 GA模型大鼠踝关节滑膜增生，减少关节组织炎性细胞浸润。结论ACYVADCMK对尿酸钠晶体诱导大鼠GA有显著的改善作用，其机制可能与降低IL1β水平有关。
【关键词】 ACYVADCMK;尿酸;关节炎，痛风性;白细胞介素1
[ABSTRACT] Objective To study the effect of Caspase1 inhibitor ACYVADCMK on acute gouty arthritis (GA) induced by monosodium urate in rats. Methods Fifty healthy female Wistar rats were enrolled and equally randomized to five groups as: blank control (group A)， model (group B)， colchine (group C)， lowACYVADCMK (group D) and highACYVADCMK (group E). GA models were made using sodium urate crystal and medicating for three days: normal saline for the rats in groups A and B; colcnine for those in group C; different doses of ACYVADCMK for groups D and E. The circumference of the ankle joints was measured by tape at 2 h， 4 h， 6 h， 8 h， 24 h， 48 h， and 72 h after modeling. At 72 h after modeling， blood was taken from the hearts under anesthesia and the articular cavities were irrigated with normal saline， a white blood count was done. IL1β in joint douche was detected by radioimmunoassay. Pathological changes in synovium of joint were observed with HE staining. ResultsAt 72 h after modeling， ACYVADCMK could significantly relieve arthrocele in rat and decline leucocytes in blood and in rinse solution of joint (F=10.34-44.66，P&<0.01). Radioimmunoassay revealed that ACYVADCMK could greatly reduce levels of IL1β in blood and in rinse solution of joint (F=4.34，4.49;P&<0.01). Histopathologically， ACYVADCMK could abate synovium proliferation of ankle joint，reduce inflammatory cell infiltration of articlar tissue. Conclusion ACYVADCMK has remarkable effect on improving symptoms of acute gouty arthritis induced by monosodium urate crystals in rats，which might be related to its inhibition on levels of IL1β.
　　[KEY WORDS] ACYVADCMK; Uric acid; Arthritis， gouty; Interleukin1
　　痛风性关节炎(GA)是尿酸盐结晶沉积于关节及周围组织所致的一种代谢性关节疾病。尿酸钠(MSU)晶体已被证实为GA发作的关键因素，由MSU晶体刺激诱导的固有免疫应答在GA的发病中起着重要的作用。在NALP3 inflammasome参与下生成的白细胞介素1β(IL1β)是GA发作的关键因子[1]。ACYVADCMK是一种Caspase1 抑制剂，可以阻断Caspase1激活前体IL1β，减少成熟IL1β的产生。本研究通过关节局部注射MSU晶体诱导大鼠GA模型，以观察Caspase1 抑制剂对GA的影响。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验动物
　　健康雄性Wistar普通级大鼠50只， 体质量(200±20)g，由青岛市药检所提供，饲养于我院动物实验中心，使用前适应性喂养1周，饮食、饮水、活动正常，无不良反应即开始实验。整个实验过程中自由摄食和饮水。
　　1.2 主要试剂
　　秋水仙碱片(西双版纳药业有限责任公司，批号070101)，吐温80(Sigma 分装，C283)，尿酸(Alfa Aesat， Lot：10105129)，acetyltyrosylvalylalanylaspartylchloromethylketone (ACYVADCMK)购于ALEXIS，批号260028M005， 大鼠IL1β酶联免疫吸附反应检测试剂盒(R&&D 分装)。
　　1.2.1 药物配置 ①秋水仙碱乳悬液：将秋水仙碱片放入研钵内研成细末、过筛。将10 mg秋水仙碱溶解于100 mL生理盐水中，制备成100 mg/L秋水仙碱混悬液。②ACYVADCMK溶液：每天早晨将5 mg ACYVADCMK溶于30 mL PBS溶液中。
　　1.2.2 MSU结晶及溶液的制备 参考CODERRE等[2]介绍的方法略作改进，在194 mL 蒸馏水中加入1 mol/L NaOH 6 mL，煮沸，加尿酸1 g，用1 mol/L HCl调pH值至7.2，搅拌冷却，4 ℃冰箱保存24 h，去上清液，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入干燥箱，70 ℃烘2 h，取出，刮下粉末，放入研钵内研成细末，用孔径200 μm的金属网筛过筛，装瓶备用。实验前MSU结晶180 ℃烘3 h，500 mg MSU结晶加9 mL生理盐水，再加1 mL吐温80，加热搅拌，配成10 mL 50 g/L MSU溶液。
　　1.3 模型的制备
　　用6号注射针从受试大鼠右后肢踝关节背侧45°方向插入胫骨肌腱内侧，将0.05 mL MSU溶液注入到踝关节腔，制备急性GA模型 (参考文献[2，3]并略作改进)。
　　1.4 实验分组及给药方法
　　将50只大鼠随机分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、秋水仙碱组(C组)、低剂量ACYVADCMK组(D组)、高剂量ACYVADCMK组(E组)，每组10只。C组给予秋水仙碱1 mL/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续灌胃3 d;A组和B组造模后灌胃等量的生理盐水，连续3 d;D组腹腔注射ACYVADCMK 0.1 mg/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续3 d;E组腹腔注射ACYVADCMK 0.3 mg/100 g，造模后开始给药，早晚各一次，连续3 d。
　　1.5 观察指标及评价方法
　　观察指标包括周径、肿胀情况[3]。①周径测量：通过皮尺测量实验前和造模后2、4、6、8、24、48和72 h右踝关节同一部位的周径。②炎症指数分级标准：正常为0级(0分);关节皮肤红斑，轻度肿胀，骨性标志可见为1级(2分);关节明显红肿，骨性标志消失，但肿胀局限于关节部位为2级(4分);关节以外肢体肿胀为3级(6分)。
　　1.6 标本采集及检测
　　造模后72 h，以100 g/L水合氯醛0.8 mL麻醉大鼠后心脏取血，1 mL注入EDTA抗凝管，其余注入普通管。抗凝血用CELLDYN1700细胞计数仪在2 h内进行白细胞计数，检测前混匀。非抗凝血37 ℃温育30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清置于-70 ℃冰箱冻存。关节腔内用0.5 mL生理盐水冲洗，留取冲洗液，取0.05 mL立即镜检计数白细胞。冲洗液置于-70 ℃冰箱冻存。血清及关节冲洗液IL1β检测采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书进行。分别取踝关节滑膜于40 g/L中性甲醛溶液固定，100 g/L乙二胺四乙酸脱钙，常规脱水、透明、包埋、切片和苏木精伊红染色，光镜下观察局部病理组织学变化。
　　1.7 数据处理与统计学分析
　　结果以±s表示，采用SPSS 16.0软件处理。各组均数间比较采用oneway ANOVA分析，组间两两比较采用LSD检验。
　　2 结 果
　　2.1 一般情况
　　入组大鼠50只，均进入结果分析，无脱失。造模后大鼠明显烦躁不安，右踝关节明显红、肿、热、痛，且伴有功能障碍，活动受限。对照组无明显躁乱表现，关节与造模前相比略有增粗，无明显红、热及功能障碍的表现。
　　2.2 药物对GA大鼠踝关节周径的影响
　　造模后各组大鼠关节肿胀度均有所增加，且8～24 h达到高峰，其中以B组最为明显， 与A组比较有显著统计学意义(F=10.34～41.56，P&<0.01)。各药物干预组关节肿胀程度与B组相比均有不同程度的下降，D组与B组相比无统计学意义，E组从4 h开始与B组相比有显著统计学意义(P&<0.05、0.01)，C组从8 h开始与B组相比有显著统计学意义(P&<0.05、0.01)。见表1。
　　2.3 药物对GA大鼠踝关节炎症指数的影响节炎症指数有显著统计学意义(F=44.66，P&<0.01)，D组踝关节炎症指数与B组相比无统计学意义。见表2。
　　2.4 药物对GA大鼠关节冲洗液及血液白细胞的影响
　　B组与A组相比血及关节液白细胞数均有显著统计学意义(F=10.44、10.65，P&<0.01)。各药物干预组血液白细胞数与B组相比，E组及C组关节冲洗液白细胞数与B组相比有显著统计学意义(P&<0.01)，而D组关节冲洗液白细胞数与B组相比无统计学意义。见表2。
　　2.5 药物对GA大鼠关节冲洗液及血清IL1β水平的影响
　　B组与A组相比，E组与B组相比，C组与B组相比血及关节冲洗液IL1β水平差异均有显著统计学意义(F=4.34、4.49，P&<0.01)，而D组与B组相比无统计学意义。见表3。
　　2.6 药物对GA大鼠关节滑膜组织的影响
　　A组大鼠关节滑膜及周围组织正常，无炎性细胞浸润;B组大鼠关节炎症较显著，表面充血水肿，可见大量的炎性细胞浸润，滑膜呈现增生样改变;D组与B组相比无明显改善;E组及C组关节炎症均不同程度地减轻，周围软组织充血不显著，见少量炎性细胞浸润，滑膜略有增生样改变。表1 不同时间各组大鼠踝关节周径变化表2 尿酸盐致炎72 h后各组大鼠踝关节炎症指数、血及关节液白细胞数表3 尿酸盐致炎72 h后各组大鼠血及关节液IL1β水平
　　3 讨 论
　　自从MC CARTY等[4]应用MSU晶体制备急性GA模型以来，该模型已是国际上常用的GA模型。本实验中，大鼠关节注射MSU致炎后，关节出现显著的肿胀，病理组织学观察结果显示大鼠关节表面充血水肿，可见大量的炎性细胞浸润和滑膜增生。表明本实验GA模型的制备是成功的。
　　IL1β是一种前炎症细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生，内皮细胞、成纤维细胞、T 细胞和 B 淋巴细胞、中性粒细胞也可产生IL1β[5]，并且多存在血及组织液中。最近研究发现，IL1β已成为GA的发病过程中的关键因子[1，6]，对于GA的形成和破坏发挥重要作用[7]。
　　痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病[8]，当MSU晶体沉积于关节及周围组织就会导致急性GA发作。 MARTINON等[1]的结果显示，MSU晶体可以激活单核细胞中的NALP3 inflammasome，并通过一种ASC调节分子与Caspase1相互作用，导致Caspase1裂解，产生酶活性。Caspase1又称为IL1转化酶，可加工前体IL1β，产生成熟的IL1β，并分泌于细胞外。IL1β可以通过与滑膜细胞、内皮细胞、成纤维细胞等上的IL1β受体相互作用，激活结头蛋白MyD88，继而启动NFKB，触发继发性的炎性细胞因子转录，产生大量的细胞因子包括IL1β、 TNFα、IL6以及嗜中性粒细胞趋化因子CXCL8[9～11]， 导致中性粒细胞进入关节等尿酸盐沉积部位，而中性粒细胞入侵后又可以增强 IL1β与其受体结合，促使更多中性粒细胞入侵[12]，从而引起关节炎症反应。此外， IL1β可激活破骨细胞并使其分化，还能作用于神经元，触发机体对炎症所致疼痛的过度敏感[13]。SO等[14]对10例应用非甾体消炎药无效的痛风病人，给予IL1β受体拮抗剂anakinra 100 mg，连用3 d，病人症状明显缓解。

转贴于 　　本实验研究结果显示，模型组大鼠关节冲洗液及血清IL1β水平明显高于空白对照组，提示IL1β水平的升高与GA的发病关系密切。秋水仙碱用于GA的治疗已有几个世纪的历史了，作为痛风治疗的特效药，其治疗剂量和中毒剂量接近(治疗剂量0.015 mg/kg，中毒剂量0.1 mg/kg[15])，作用机制尚不明确，可能是通过与粒细胞微管蛋白结合妨碍粒细胞的活动，抑制粒细胞浸润，也可能与膜攻击复合体或CD14分子作用[16，17]，减低白细胞活动和吞噬作用及减少乳酸形成从而减少MSU结晶的沉积，或者干扰MSU结晶与NALP3 inflammasome的作用，减轻炎性反应，而起止痛作用。秋水仙碱也可减少内皮细胞黏附分子的表达，从而减少中性粒细胞的聚集。主要用于急性痛风，对一般疼痛、炎症和慢性痛风无效。本实验结果显示，秋水仙碱可降低大鼠踝关节的肿胀度，减少大鼠踝关节的组织水肿，降低血及关节液中白细胞数量，降低IL1β水平，减少炎性细胞浸润，减轻滑膜增生等病理改变。秋水仙碱降低IL1β的作用与国外同类研究结果一致[1]。ACYVADCMK为Caspase1抑制剂，通过抑制Caspase1，使其加工前体IL1β产生成熟IL1β的能力减弱，从而减少IL1β的产生。本实验中低剂量ACYVADCMK(0.1 mg/100 g)对大鼠急性GA的症状没有明显改善，而高剂量ACYVADCMK(0.3 mg/100 g)可不同程度降低大鼠踝关节的肿胀度，减少大鼠踝关节的组织水肿，降低血及关节液中白细胞数量，降低IL1β水平，减少炎性细胞浸润，减轻滑膜增生等病理改变。其作用可能与其抑制IL1β的生成有关。因此， IL1β可能作为急性痛风发作治疗的新切入点。

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