关于缬沙坦对单侧输尿管梗阻模型大鼠肾间质纤维化作用

　　　　　　 作者：王凯 孙建平 刘丽秋 马瑞霞 李玉山 周立冬

【摘要】 目的 研究血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂缬沙坦对单侧输尿管梗阻(UUO) 模型大鼠肾间质纤维化进程的作用。方法 健康 Wistar大鼠单侧输尿管结扎制备UUO模型，并分为模型组(n=18)、缬沙坦组(n=18，30 mg·kg-1·d-1 灌胃);以切开腹腔并游离左侧输尿管但不结扎和剪断大鼠作为对照组(n=12)。分别于术后3、10、20 d处死大鼠，全自动生化仪检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平，免疫组织化学方法检测肾组织骨桥蛋白(OPN)的表达，RTPCR方法检测肾组织中转化生长因子β1(TGFβ1) mRNA的表达。结果 与对照组相比，模型组和缬沙坦组Scr及BUN自术后第10天起均显著上升(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87，P&<0.05);术后第3天模型组OPN及TGFβ1 mRNA表达均上调，缬沙坦组OPN自第3天亦显著增加，但TGFβ1 mRNA的表达自第10天起才显著增加(F=11.70～231.51，q=4.74～30.42，P&<0.05、0.01)。与模型组比较，缬沙坦组术后第3天OPN表达无显著差异，但TGFβ1 mRNA表达显著降低(q=3.92～15.11，P&<0.05)。结论 OPN、TGFβ1参与了肾间质纤维化的进展;缬沙坦可能通过抑制OPN及TGFβ1的表达抑制UUO大鼠肾间质纤维化进程，延缓肾损害进展。
【关键词】 缬沙坦;血管紧张素Ⅱ;纤维化;输尿管梗阻;骨桥蛋白
[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of angiotensinⅡtype 1 receptor antagonist (valsartan) on renal interstitial fibrosis caused by unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats. Methods A UUO model in Wistar rats was made by ligating unileteral ureter. The 36 model rats were evenly pided into two groups: model group and valsartan group (30 mg·kg-1·d-1). The 12 rats served as controls received only mobilization of the left ureter without cutting or ligation. The rats were sacrificed 3， 10 and 20 days after the surgery. Blood Cr and BUN were measured by automatic chemical analyzer， the expression of OPN was analyzed by immunohistochemistry.The expression of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) mRNA was detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results Compared with the control， Cr and BUN in the model and valsartan groups were significantly increased from the 10th day after the operation (F=11.75-40.83，q=3.32-11.87，P&<0.05). In model group， the expressions of OPN and TGFβ1 mRNA upregulated; in valsartan group， OPN increased from the third day after surgery， but TGFβ1 mRNA increased starting from the 10th day (F=11.70-231.51，q=4.74-30.42，P&<0.05，0.01). Compared with model group， the difference of OPN expression in valsartan group on the third day was not significant， but TGFβ1 mRNA decreased significantly (q=3.92-15.11，P&<0.05). Conclusion OPN and TGFβ1 involve in the process of interstitial fibrosis in the kidney; valsartan inhibits the interstitial fibrosis and delay renal demage of UUO in rats probably by suppressing the expressions of OPN and TGFβ1 mRNA.
　　[KEY WORDS] Valsartan; AngiotensinⅡ; Fibrosis; Ureteral obstruction; Osteopontin
　　肾间质纤维化是各种原因导致的进行性肾脏疾病最重要的病理特点之一，是慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路[1，2]。而其中细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致ECM在肾间质的广泛沉积是肾间质纤维化发生的本质[2]。肾间质纤维化的促进因素涉及范围较广， 转化生长因子β1 (TGFβ1)是目前公认的强致纤维化因子[4]。骨桥蛋白(OPN)存在于多种生物中，可以多种不同的成熟形式存在于不同的组织细胞及正常体液中，具有多种生物学效应，可以引起大量炎性细胞浸润，而炎性细胞可产生TGFβ1，参与间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞ECM的过量合成，最终导致肾间质纤维化的发生。本实验选用TGFβ1、OPN作为观察指标，探讨缬沙坦抗肾间质纤维化的作用机制，为临床应用提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物模型的建立与分组
　　50只雄性Wistar大鼠(青岛药检所动物中心提供)，体质量180～200 g，饲养于温控和光控动物室，适应性喂养1周后，随机分为对照组(12只)和实验组(38只)。实验组大鼠切开腹腔并游离左侧输尿管，用40线结扎左肾下极水平及左输尿管入膀胱处，然后在两结扎点间剪断输尿管，逐层缝合腹壁，建立UUO模型;对照组仅切开腹腔并游离左侧输尿管但不结扎和剪断。实验组共有36只大鼠造模成功，其中2只因手术失血死亡，36只大鼠随机分为模型组18只、缬沙坦组18只。缬沙坦组于术后第1天开始给予缬沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，直至大鼠处死前;对照组及模型组灌等量生理盐水。术后第3、10、20天对照组各处死4只大鼠，其余两组各处死6只大鼠。取左侧部分肾组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋;其余肾组织快速液氮冷冻，-80 ℃保存。
　　1.2 观察指标及方法
　　1.2.1 生化指标的测定 处死大鼠前腹主动脉穿刺取血，采用美国LANDMARK公司生产全自动生化仪(型号AGⅡ)分别测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。
　　1.2.2 肾脏组织病理学观察 石蜡包埋组织切片，片厚2 μm，行常规苏木精伊红染色，在200倍光镜下观察肾小管间质病变情况。
　　1.2.3 OPN检测 采用EliVision法，抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，切片厚度2 μm，一抗为兔抗大鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗为羊抗兔IgG(1∶100)，DAB显色，并以0.01 mmol/L PBS缓冲液作为空白对照。采用ImagePro Plus病理图像分析软件，每张切片随机采集10个视野，检测阳性目标累积吸光度、空白区域面积，计算切片平均吸光度，用其反映OPN的表达强度。
　　1.2.4 TGFβ1 mRNA表达检测 采用RTPCR方法，以Simply P 总RNA提取试剂盒(杭州博日生物科技有限公司)提取总RNA，严格按照其说明书操作。在核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf)上测定总RNA的吸光度(A)值并计算其浓度。RT及PCR操作步骤按照试剂盒说明书进行(日本TAKARA公司)。TGFβ1 引物：正义链5′GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA3′，反义链 5′GGAAGGGTCGGTTCATGTCAT3′，扩增产物长度为197 bp。GAPDH引物：正义链5′GCAAAGTGGAGATTGTTGCCAT3′，反义链 5′CCTTGACTGTGCCGTTGAATTT3′，扩增产物长度为108 bp。TGFβ1的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共32个循环;GAPDH的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环;最后均72 ℃终末延伸10 min。取上述扩增产物5 μL在含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线透射凝胶成像仪(法国VilberLourmat 公司)检查有无特异条带并扫描各电泳带的灰度值，用美国BioRad公司的Molecular Analyst软件进行半定量分析，计算其与内参照GAPDH吸光度比值。
　　1.3 统计学处理
　　以SPSS 10.0统计软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验。均数的多组间比较采用方差分析。
　　2 结 果
　　2.1 各组大鼠术后不同时间生化指标的比较
　　与对照组比较，模型组及缬沙坦组大鼠术后第3天Scr及BUN差异无显著性(P&>0.05)，第10、20天时显著增高，差异有统计学意义(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87，P&<0.05)。与模型组相比，缬沙坦组Scr及BUN术后第10、20天均较低，差异有显著性(q=3.36～9.55，P&<0.05、0.01)。见表1、2。
　　2.2 术后大鼠肾脏组织病理学的改变
　　光镜下观察，术后第3天，模型组大鼠肾小管上皮细胞呈灶状空泡和颗粒变性，肾间质偶见灶状淋巴和单核细胞浸润，肾小管上皮细胞除变性外，部分出现崩解脱落及再生，部分呈灶状上皮细胞萎缩，管腔扩张，萎缩小管周围出现纤维化，伴少量淋巴和单核细胞浸润;第20天后肾间质纤维化及肾小管萎缩加重，呈多灶分布。肾小球始终无明显变化。各时间点治疗组与模型组相比，未见明显形态学差异。对照组大鼠肾脏无形态学异常。
　　2.3 各组大鼠术后不同时间肾组织OPN表达的比较
　　对照组肾组织中OPN主要表达于部分肾小管近曲小管、远曲小管、髓袢升支粗段及一些集合管上，肾间质未见着色;与对照组相比，模型组及缬沙坦组大鼠自第3天起OPN在肾小管间质的阳性染色强度明显升高， 差异有显著意义(F=64.36～231.51，q=14.17～30.42，P&<0.01);与模型组比较，缬沙坦组大鼠从第10天起在肾小管间质的阳性染色强度明显降低，差异有显著性(q=5.85、14.30，P&<0.01)。见表3。
　　2.4 各组大鼠术后不同时间肾组织中的TGFβ1 mRNA表达比较
　　与对照组相比较，模型组及缬沙坦组肾组织TGFβ1 mRNA的表达自术后第3天起明显增加，差异均有显著意义(F=11.70～98.41，q=4.74～18.26，P&<0.05、0.01)。与模型组相比，缬沙坦组TGFβ1 mRNA表达值降低，差异有显著性(q=3.92～15.11，P&<0.05、0.01)。见图1及表4。表1 术后不同时间各组大鼠Scr值比较表2 术后不同时间各组大鼠BUN值比较与对照组比较，F=11.81、40.83，*q=6.82、11.87，P&<0.01，△q=3.32、3.48，P&<0.05;与模型组比较，#q=3.74，P&<0.05，q=9.55，P&<0.01
　　表3 不同时间点各组大鼠肾组织OPN免疫组化表达强度比较(±s)组 别n第3天第10天第20天对照组40.20±0.04 0.19±0.02 0.23±0.02 模型组60.60±0.07*0.90±0.08* 1.30±0.10* 缬沙坦组60.59±0.06*0.75±0.06*#0.85±0.07*# 与对照组比较，F=64.36～231.51，*q=14.17～30.42，P&<0.01;与模型组比较，#q=5.85、14.30，P&<0.01
　　图1 第20天3组TGFβ1 mRNA表达RTPCR检查结果
　　A：对照组，B：模型组，C：缬沙坦组 表4 术后不同时间各组大鼠肾组织TGFβ1 mRNA表达比较(A，±s)组 别n第3天第10天第20天对照组40.582±0.062 0.646±0.037 0.674±0.043 模型组60.769±0.075*0.949±0.056* 1.410±0.107* 缬沙坦组60.672±0.0400.808±0.039*#0.864±0.088△# 与对照组比较，F=11.70～98.41，*q=6.77～18.26，P&<0.01，△q=4.74，P&<0.05;与模型组比较，q=3.92，P&<0.05，#q=7.52、15.11，P&<0.01
　　3 讨 论
　　肾小管间质纤维化是慢性肾衰竭的重要病理表现，其与慢性肾衰竭的关系越来越受到重视。TGFβ1具有促进成纤维细胞和肾小管上皮细胞表型转化及促进ECM合成的作用[6]，并且还能通过减少基质降解酶(主要为基质金属蛋白酶，即MMPs)生成及增加基质降解酶抑制物(如TIMPs等)合成而抑制ECM降解，导致肾间质ECM(包括Col Ⅰ)蓄积[7，8]。另外，已经证实巨噬细胞与肾脏固有细胞及ECM相互作用导致组织损害，可以促进肾间质纤维化。近年大量的研究均提示，肾间质巨噬细胞积聚的程度与相应部位的纤维化程度呈正相关，原因为肾间质积聚的巨噬细胞可以产生包括TGFβ1在内的一系列促纤维化因子，活化间质纤维母细胞产生细胞外基质而导致间质纤维化。有研究表明，趋化因子OPN表达上调是引起间质巨噬细胞积聚的直接原因，OPN可以介导巨噬细胞的黏附和迁移[9]。OPN 对T 细胞也具有趋化、激活作用，并能促进T 细胞的增殖，抗OPN 中和抗体能显著抑制T 细胞聚集、活化。因此，OPN 既是一种趋化因子也是一种激活因子。肾脏损伤之后，肾小管细胞中OPN 的表达和管周局部的巨噬细胞浸润密切相关。有研究表明，体内OPN的高表达常与疾病活动相关[10]。LAMEIRE 等[11]研究显示，抗OPN 抗体能够有效地对抗巨噬细胞诱导大鼠新月体肾炎的发生。

　　肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在肾脏病进展和恶化中起主要作用，阻断RAS可以保护肾功能。有研究结果显示，AngⅡ的致生长作用是通过自分泌或旁分泌TGFβ1实现的[12]。AngⅡ能刺激TGFβ1增加，其机制是AngⅡ通过血管紧张素Ⅱ受体1(AT1)提高TGFβ1的mRNA水平，促使无活性的TGFβ1向其活性形式转化[13]，TGFβ1活化或活性升高是肾脏纤维化过程中的最终的共同调节因子。同时，AngⅡ也是巨噬细胞直接趋化因子，使血管内皮细胞和近端肾小管上皮细胞黏附因子表达增加，诱导单核细胞趋化蛋白1和OPN原位表达。随着OPN表达量的增加，OPN又可以诱导单核巨噬细胞等炎细胞浸润，分泌TGFβ1等生长因子;另外，巨噬细胞也能合成RAS成分，进而促进OPN的表达和巨噬细胞的浸润; TGFβ1又可以进一步活化NFκB 而调控炎症因子的表达，促使OPN、MCP1等过度表达，从而形成正反馈恶性循环。在UUO模型中，肾组织中有大量的AngⅡ，其主要受体AT1R的表达亦明显增多。阻断TGFβ1信号或用ACEI 类药物均可阻断上述炎症过程[14]。另有研究显示，每天给大鼠注射牛血清清蛋白诱导制成蛋白尿模型后，肾间质可发生炎症及纤维化，并且在第4天时可见肾皮质中OPN mRNA 的表达显著升高，而1 周以后TGFβ及巨噬细胞的表达才升高，可见OPN 在早期病变中即起到重要作用[15]。
　　缬沙坦是第一个应用于临床的口服非肽类AngⅡ1型受体拮抗剂(AT1RA)，可通过血流动力学和非血流动力学作用对抗细胞外基质沉积，延缓肾脏纤维化进展。缬沙坦通过阻断AngⅡ受体，进而阻抑TGFβ1及OPN的激活，从而延缓肾纤维化的发生发展。对AngⅡ在肾间质纤维化中作用机制的研究可为AT1RA的临床应用提供理论依据。
　　本文实验结果显示，随肾脏病变程度进展，模型组大鼠OPN蛋白及TGFβ1 mRNA表达均逐渐增强，证实OPN及TGFβ1能够促进肾间质纤维化，这与国外研究一致。应用缬沙坦治疗后，以上指标均明显下降，提示缬沙坦对肾脏纤维化的抑制作用可能是通过抑制TGFβ及OPN的表达实现的。因此，使用AT1RA(缬沙坦)对UUO模型大鼠进行早期干预，可减轻小鼠肾间质纤维化程度，改善小鼠肾功能。
【参考文献】
　[1]STAHI P J， FELSEN D. Transforming growth factorbeta， basement membrane， and epithelial mesenchyatransdifferentiation: implications for fibrosis in kidney disease[J]. Am J Pathol， 2001，159:11871192.

　　[2]MULLER G A， Z EISBERG M， STRUTZ F. The importance of tubulointerstitialda mage in progressive renaldisease[J].N ephrol Dial Transplant， 2000，15:7677.

　　[3]KUNCIO G S， NEILSON E G， HAVERTY T. Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis[J]. Kidney Int， 1991，39:550556.

　　[4]HULLINGER T G， PAN Q， VISWANATHAN H L， et al. TGF beta and BMP2 activation of the OPN promoter: roles of smadand hoxbinding elements[J]. Exp Cell Res， 2001，262(1):6974.

　　[5]VERHULST A， PERSY V P， VAN ROMPAY A R， et al. Osteopont in syn2 thesis and localization along the human nephron[J]. J Am Soc Nephrol， 2002，13(5):12101218.

　　[6]LIU Y. Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics[J]. Kidney Int， 2006，69:213217.

　　[7]DOUTHWAITE J A， JOHNSON T S， HAYLOR J L， et al. Effects of transforming growth factorβ on renal extracellular matrix components and their regulating proteins[J]. J Am Soc Nephrol， 1999，10(10):21092119.

　　[8]庄文青，刘美荣. TGFβ1与肾小球硬化性疾病关系的研究进展[J]. 齐鲁医学杂志， 2001，16(2):166167.

　　[9]HIRAMAA M， TAKAHASHI F， TAKAHASHIA K， et al. Osteopontin overproduced by tumor cells acts as a potent angiogenenic factor contributing to tumor growth[J]. Cancer Lett， 2003，198(1):107117.

　　[10]董辉，马瑞霞，宋起. 血浆骨调素水平与系统性红斑狼疮活动性的关系[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43(6)：523524.

　　[11]LAMEIRE N， VANHOLDER R. Psthophysiologic features and prevention of human and experimental acute tubular necrosis[J]. J Am SocNephrol， 2001，12(Suppl 17):S20S32.

　　[12]黄海长，李惊子，王海燕. 结缔组织生长因子诱导肾成纤维细胞转为成肌纤维细胞[J]. 科学通报， 2002，47(1):3840.

　　[13]ZOJA C， ABBATE M， CORNA D， et al. Pharmacologic control of AngⅡ ameliorates renal disease while reducing renal TGFβ in experimental mesangioproliferative glomerulonephritis[J]. Am J Kidney Dis， 1998，31:453463.

　　[14]MEZZANO S A， RUIZORTEGA M， EGIDO J. Angiotensin Ⅱ and renal fibrosis[J]. Hypertension， 2001，38(3 Pt 2):635638.

　　[15]NANGAKU M. Mechanisms of rubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to endstage renal failure[J]. Intern Med， 2004，43(1):917