卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响

【摘要】 目的 观察卡托普利晚期预适应对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响。方法 建立培养乳鼠心室肌细胞缺氧/复氧损伤模型。设正常对照组、缺氧复氧组、缺氧预适应组和卡托普利预适应组。利用激光共聚焦显微镜观察ATP敏感钾通道含量的变化。结果 培养的心室肌细胞的Kir6.1及Kir6.2通道蛋白主要在胞浆表达。Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。结论 卡托普利晚期预适应作用的发挥与ATP敏感钾通道的蛋白表达增加有关。

【关键词】 卡托普利； 缺氧复氧； ATP敏感钾通道； 激光共聚焦显微镜；心室肌细胞

研究显示血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）在防治再灌注性心律失常〔1〕，心肌顿抑和心肌坏死〔2〕等方面显示了较好的治疗效果，ACEI预适应的心脏保护作用愈来愈受到重视。ATP敏感钾通道被认为是缺血预适应信号级联反应中的重要效应因子，实验证实ATP敏感钾通道的开放在心脏保护中具有重要作用〔3〕。本实验利用激光共聚焦显微镜研究了在卡托普利晚期缺血预处理过程中ATP敏感钾通道含量的变化，旨在探讨ACEI的晚期缺血预处理作用的离子通道机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　IMT2倒置显微镜（OLYMPUS日本），二氧化碳培养箱(RAK 日本)。胎牛血清和含各种氨基酸和葡萄糖的（DMEM）合成培养基(Gibco公司)。激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，美国Meridian公司)。一抗：兔抗鼠钾通道蛋白（Kir）6.1及Kir6.2多克隆抗体（USA，BD公司）；二抗：荧光标记羊抗兔抗体（IgG/FITC）（美国SantaCruz公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 新生大鼠心肌细胞的原代培养〔4，5〕

　　取新生1～4 d Wistar大鼠(吉林大学医学部实验动物部提供)，仰卧固定，75%酒精消毒皮肤，开胸摘取心脏。于预冷无钙镁磷酸缓冲液（PBS）的平皿中，剪取心室肌组织成1 mm3碎块，放入三角烧杯中，用0.1%胰蛋白酶分次消化，轻吹打，静置2 min，自然沉淀，弃上清。沉淀再次消化反复2次后取上清；移入无菌离心管中，加入4℃预冷含小牛血清的DMEM终止胰酶作用，轻吹、混匀后，1 000 r/min×10 min、4℃离心、弃上清，反复3次，以洗去残存胰酶；以差速贴壁法纯化心肌细胞，使纯度达到90%以上。 以1.5×106/ml接种于预先用50 mg/L多聚赖氨酸涂布过的2.5 cm2培养瓶，在37℃、95% O2+5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。每2日更换一次培养基，取培养4日的单层细胞进行实验。在培养瓶中加入无菌的盖玻片，制备心肌细胞爬片。

　　1.2.2 爬片鉴定

　　采用肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色法，显示心肌细胞纯度达90%以上。

　　1.2.3 心肌细胞缺氧、复氧及模拟缺血模型的制备〔6〕
　　
　　参照Koyama等的方法。培养的心肌细胞生长接近融合状态时，弃去培养液，加入缺氧液并向培养瓶中冲入100%氮气，以置换培养瓶中的空气，用胶塞密闭瓶口，即缺血缺氧模型。复氧时，将缺氧液倒掉，加入复氧液并开放培养瓶瓶口，即为复氧模型。

　　1.2.4 实验分组

　　对照组：细胞置于DMEM培养基中于5% CO2、37℃，饱和湿度培养皿中培养；预适应组：细胞于缺氧液、100%氮气，37℃条件下培养5 min后，换复氧液，并恢复5% CO2气体环境培养5 min，反复循环4次，24 h后再于上述缺氧环境中缺氧30 min，复氧90 min；缺氧复氧组：细胞于上述缺氧环境中缺氧30 min，复氧90 min；卡托普利预处理组：卡托普利与细胞共同孵育24 h后，再行缺氧30 min，复氧90 min（卡托普利的终浓度为102mol/L）。

　　1.2.5 爬片制备

　　①固定：用多聚甲醛固定20 min；②漂洗：以0.01 mmol/L PBS（pH7.4）振洗3 min，共洗3次；③以0.3%过氧化氢室温处理30 min，封闭内源性过氧化物酶的活性；④PBS漂洗2 min，共2次；⑤3%正常灭活羊血清室温孵育30 min，以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色；⑥轻轻弃去孵育液，不冲洗，滴加第一抗体（1∶30稀释），37℃湿盒内孵育1 h，4℃冰箱过夜；⑦PBS充分冲洗5 min，共3次，以除去非特异性吸附的抗体；⑧滴加带荧光标记的二抗（1∶50稀释），湿盒内孵育30 min，PBS振洗3 min，共3次。

　　1.2.6 LSCM观察

　　用无荧光的缓冲甘油封片后直接在LSCM下观察并拍照。用于FITC的激发波长为488 nm，共聚焦系统由BioRad公司提供的软件控制，在Penium90计算机中进行，显微镜聚焦旋钮由步进马达控制。用于图像采集的物镜为Planneofluar40×物镜，7%滤光片，进入KineticsImagascan程序，预扫描后选定最佳参数，选定视野扫描并储存所获信息，各组扫描至少6个视野，细胞总数在100个以上。数据采集完成以后，进入KineticsImaga Scan Analysis程序分析和处理各次实验存储数据。

　　1.3 统计学处理

　　数据以x±s表示，两组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　LSCM将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共聚焦显微细胞仪的检测技术结合起来，可较准确地定量细胞中蛋白质的变化，被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示。Kir6.1及Kir6.2通道蛋白主要在胞浆表达。培养的心室肌细胞的Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。见表1，图1。表1 各组荧光强度的比较(略)

　　3 讨 论
　　
　　在缺血再灌注损伤及预适应的研究中对ATP敏感钾通道的探讨大多局限在其功能状态方面，而对其分子水平的变化研究甚少。本实验利用LSCM研究了在卡托普利晚期缺血预处理过程中ATP敏感钾通道含量的变化。参与组成ATP敏感钾通道的Kir为内向整流ATP通道，家族成员包括Kir6.1、Kir6.2〔7，8〕。 ATP敏感钾通道不仅分布于细胞膜，还广泛分布于细胞内膜性细胞器的膜上〔9〕。本实验也证实了这一点，Kir6.1、Kir6.2的表达均定位在细胞浆。实验结果显示：培养的心室肌细胞的Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。Crestanello〔10〕曾报道缺血再灌注损伤时心肌Kir6.1的mRNA及蛋白质水平上调。如果给予血管紧张素II的I型受体拮抗剂或ACEI进行预处理，Kir6.1的mRNA及蛋白质上调水平就会受到抑制。本实验结果与文献报道的不符，可能与所用的ACEI种类不同和选择的时间点不同有关，但这方面的报道相对很少。另有报道〔11〕示对培养的心肌细胞或在体心脏经过Urocortin（促肾上腺皮质激素释放激素家族中的一种肽，已被证实在缺血再灌注损伤时有心肌保护作用）预处理后，可提高缺血再灌注时Kir6.1的mRNA及蛋白质的表达。本实验结果得出的结论是：ACEI的晚期预适应作用的发挥不仅与ATP敏感钾通道的开放有关，还与其蛋白表达增加有关。
　　

参考文献

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　　10 Crestanello JA，Doliba NM，Babsky AM，et al.Ischemic preconditioning improves mitochondrial tolerance to experimental calcium overload〔J〕.J Surg Res，2002；103(2):24351.

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