长期应用不同剂量左旋多巴对帕金森病大鼠模型学习记忆能力和血浆同型半胱氨酸的影响

　　　　 作者：韩金红 邢红霞 殷闯 王兴平 王玉梅 丰慧根

【摘要】 目的 观察长期应用不同剂量左旋多巴(Ldopa)对帕金森病（PD）模型大鼠的学习记忆能力和血浆同型半胱氨酸(Hcy)的影响。方法 应用6羟多巴胺(6OHDA)制作PD大鼠模型。将288只成功PD模型大鼠分为对照组及实验组。实验组再分为3个不同剂量组，分别用不同剂量的Ldopa腹腔注射（10 mg/kg/d，20 mg/kg/d，30 mg/ kg/d）连续28 d，分别于不同时点（1、3、5、7、14和28 d）作行为学测定，并抽血测定Hcy、叶酸；同时分离大鼠海马区制作冰冻切片，进行刚果红染色并测定海马区β淀粉样蛋白阳性斑块的积分吸光度。结果 随着应用Ldopa剂量的增大、时间的增加可使PD模型大鼠学习记忆能力明显下降(P<0.05)；海马区β淀粉样蛋白阳性斑块增多(P<0.05)。血浆Hcy浓度变化不一，随Ldopa剂量增大而升高，随Ldopa应用时间增长而波动，叶酸浓度降低(P<0.05)。结论 长期大量使用Ldopa能使PD模型大鼠学习记忆能力明显下降，血浆Hcy浓度升高，引起β淀粉样蛋白阳性斑块增多，推测PD痴呆（PDD）可能与Hcy升高有关。

【关键词】 左旋多巴；帕金森病；学习记忆；β淀粉样蛋白；同型半胱氨酸

　　【Abstract】 Objective To observe the effects on learning and memory capacities， the plasma levels of homocysteine by levodopa (Ldopa) of the long term and different dose on Parkinson′s disease (PD) rats. Methods The model rats of PD were established by 6OHDA. The 288 model rats were randomly pided into control (CG) and levodopa groups (LG). In addition， the LG group was pided into Ldopa (10， 20， 30 mg·kg-1·d-1) subgroups respectively， each subgroup of rats was administered intraperitoneally for 28 consecutive days. At different time (1st， 3rd， 5th， 7th， 14th， 28th day)， the rats′ behavioral changes and tested plasma levels of Homocysteine (Hcy) and folic acid were observed. Preparations of hippocampus were stained by Congo red， and βprotein deposits of hippocampus were analyzed by integral absorbance(IA). Results (1) The learning and memory capacities of PD rats were significantly decreased in coincidence with the doses and the time of Ldopa (P＜0.001). The βprotein deposits in hippocampus were also increased in coincidence with the doses and the time of Ldopa (P＜0.05). (2) The plasma levels of homocysteine were significantly increased and levels of folic acid were significantly decreased in coincidence with the doses and the time of Ldopa (P＜0.001). Conclusions The long term and large dose usage of Ldopa may decrease the learning and memory capacities， and increase the βprotein deposit in hippocampus and the plasma levels of homocysteine of PD rats，which suggests that， PDD is correlated with increasing the plasma levels of homocysteine.

　　【Key words】 Levodopa; Parkinson disease; Learning and memory; βprotein deposit; Homocysteine
　　
　　PD痴呆（Parkinson′s disease dementia，PDD）发生率4%～93%不等，主要见于中、晚期PD患者，发生的机制可能为神经元变性累及皮层、海马处神经元，其临床特征为认知能力、记忆力、视觉空间等能力的受损〔1〕。帕金森病（PD）一经确诊就必须终身使用以左旋多巴(levodopa，Ldopa)为主的药物，然而随着时间的推移，这类药物逐渐暴露出诸多缺陷，可以引起异动症及精神错乱等皮层症状。现代研究表明，长期应用Ldopa治疗能够引起同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）的增高〔2〕，而Hcy的升高可以引起认知缺损及痴呆。但长期大剂量Ldopa治疗PD引起Hcy的增高是否会引起PDD国内外尚未见报道。本实验通过改良的Thomas方法〔3〕制作PD大鼠模型，探讨PD模型大鼠导致PDD是否与长期应用不同剂量的Ldopa治疗有关，以及PDD发病机制是否与Hcy的增高有关。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品、试剂与仪器
　　
　　6羟多巴胺(6OHDA)，阿扑吗啡、Ldopa均为Sigma公司产品。Y型电迷宫。岛津LC10A高效液相色谱仪，紫外检测器和荧光检测器。

　　1.2 大鼠模型制备与分组

　　成年普通级Wistar大鼠，雌雄不限，重量180～250 g，新乡医学院实验动物中心提供，各组喂养的饲料相同，且维生素B12、叶酸的量控制正常。按改良的Thomas方法制作PD大鼠模型：10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，头颅水平位固定在脑立体定位仪上，参照Paxions and Watson图谱确定右侧黑质致密部(SNc)、中脑腹侧被盖部(VTA)三维坐标位置。SNc区坐标:前囟后4.8 mm，中线右侧2.0 mm，硬膜下8.0 mm。VTA区坐标:前囟后4.8 mm， 中线右侧1.2 mm，硬膜下8.0 mm，按坐标每个点注射6OHDA 10 μg。2 w后进行行为学观察:腹腔注射阿扑吗啡0.5 mg/kg，以旋转圈数大于7 r/min的大鼠作为成功PD大鼠模型。将288只成功PD模型大鼠随机分为对照组和小、中、大剂量实验组。其中实验组216只PD大鼠（每小组72只）每日分2次于9:00和19:00用不同剂量的Ldopa腹腔注射（10，20，30 mg·kg-1·d-1），连续28 d(腹腔注射阿扑吗啡后3 d实施)。对照组72只于9:00和19:00注射均量生理盐水，连续28 d。

　　1.3 学习记忆能力检测

　　对照组随机分为6小组（各12只）；各实验组进行编号，每组再随机分为6小组，每组12只。分别于第1、3、5、7、14、28天行Y型电迷宫测试，选用电压40 V，设一臂为起步区，随机选择各臂作为安全区。选择活跃、对电击反应较敏感、逃避反应迅速的大鼠供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，最后每组淘汰4只，剩余8只大鼠。大鼠在起步区静置3 min，予电击致其逃至安全区，灯光持续15 s，然后熄灯休息1 min，开始下一次操作。①学习测试:规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以达到连续10次中9次正确反应所需的电击次数(尝试次数)表示其学习获得能力。若尝试次数超过30次则不再测试，并以30次为最大值计数。②记忆再现测试:学习测试24 h数作为记忆成绩。大鼠的学习记忆成绩以学习尝试次数和再现次数表示。

　　1.4 β淀粉样蛋白(Aβ)的刚果红染色(漂浮染色)

　　电迷宫测试结束后1 h，将动物断头处死，迅速取脑，置于冰盒上，取出大脑，分离左侧海马，15 μm冰冻切片入苏木精染液3 min，自来水漂洗玻片干净后，入1%盐酸乙醇溶液分化数秒，用自来水终止分化，再入1%刚果后复染2 min后，入0.2%碱性乙醇溶液分化数秒，至显现橘红色沉积物即可终止分化。刚果红阳性反应斑块用Leica图像分析系统进行积分吸光度(IA)测定。

　　1.5 血浆总Hcy和叶酸浓度测定

　　采集血样前1 d，所有实验大鼠禁食。各组Y型电迷宫测试后的大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，从心脏采血至肝素抗凝管中，分离血浆置-20℃保存待测。血浆Hcy及叶酸浓度测定应用高效液相色谱法(DrewDS30，英国)，荧光检测条件为激发波长385 nm，放射波长5.5 nm。采用C18反相柱和50 mmol/L KCl流动相，洗脱时间30 min，流速0.5 ml/min。

　　1.6 统计学分析

　　运用SPSS13.0软件，数据以x±s表示，采用两因素多水平重复测量的方差分析，两两比较采用q检验。以α=0.05为显著性水准。

　　2 结 果

　　2.1 各组PD大鼠学习和记忆能力测定结果

　　10 mg·kg-1·d-1 Ldopa组各时间点中学习测试结果与对照组相比，没有显著性差异（P>0.05)，而20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组各时间点学习测试结果与对照组相比具有显著性差异；其中，第14天及第28天的学习能力较前显著降低，说明随着Ldopa剂量的增大、应用时间的增加可使大鼠学习能力明显下降(P<0.05)。在记忆再现测试中，亦有相同的结果：随着Ldopa剂量的增大、应用时间的增加可使大鼠记忆能力明显下降(P<0.05)。见表1，表2。表1 各组大鼠学习能力比较（略)表2 各组大鼠记忆能力比较（略)

　　2.2 Aβ阳性反应斑块结果

　　对照组大鼠海马区域背景清晰干净，视野中未见刚果红阳性斑块染色、苏木素蓝染的细胞核。10 mg·kg-1·d-1 Ldopa组背景干净，视野清晰，注射处可见少量桔红色沉积物，呈斑片状，但与对照组相比没有显著性差异，而20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组及30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组的各时间点桔红色沉积物与对照组相比增多；在20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组及30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组中，第7、14、28天的桔红色沉积物较前显著增多，即Aβ阳性斑块明显增多。各组海马区Aβ阳性斑块的IA比较显示：10 mg·kg-1·d-1 Ldopa组各时间点中海马区Aβ阳性斑块的IA与对照组相比无显著差异（P>0.05)，而20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组及30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组各时间点海马区Aβ阳性斑块的IA与对照组相比有显著性差异，其中，第7、14、28天海马区Aβ阳性斑块的IA较前显著升高（P<0.05）。见图1，表3。表3 各组大鼠刚果红染色阳性斑块IA比较（略)

　　2.3 总Hcy和叶酸浓度测定结果

　　10 mg·kg-1·d-1 Ldopa组的各时间点中总Hcy浓度与对照组相比没有显著性差异，而20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组及30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组各时间点总Hcy浓度与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；在20 mg·kg-1·d-1 Ldopa组中第28天较第14、7、5天总Hcy浓度显著增高(P<0.05)，在30 mg·kg-1·d-1 Ldopa组中随时间的增加，总Hcy浓度变化有显著性差异(P<0.05)，说明随着Ldopa剂量的增大，大鼠血浆总Hcy浓度明显升高，随着应用时间的增加可出现总Hcy浓度明显波动。同时，在实验中发现随着Ldopa剂量的增大、应用时间的增加可使大鼠血浆中叶酸浓度明显下降(P<0.05)。见表4，表5。表4 各组大鼠Hcy浓度测定结果（略)表5 各组大鼠叶酸浓度测定结果（略)

　　3 讨 论

　　给予Ldopa治疗10年后，约80%的PD患者会出现Ldopa诱发的异动症。巴茂文等认为Ldopa 25 mg/kg治疗PD模型大鼠3 w后，逐渐出现程度不同的异动症〔4〕。本实验行为学测定中发现各时间点小剂量Ldopa（10 mg·kg-1·d-1）治疗组PD大鼠学习记忆能力较对照组无明显变化，而中剂量（20 mg·kg-1·d-1）、大剂量（30 mg·kg-1·d-1）Ldopa治疗组PD大鼠学习记忆能力随Ldopa使用时间、剂量增加而降低，同时在海马病理学检测发现随着Ldopa剂量的增大、应用时间的增加可使大鼠Aβ阳性斑块明显增多。本实验提示小剂量Ldopa治疗大鼠PD的效果在学习记忆能力上无明显的影响，而随着Ldopa在大鼠体内蓄积剂量逐渐增加，其神经毒性作用逐渐加重，这一点与Smith〔5〕观点是一致的。Ldopa神经毒性作用可能与其自身氧化代谢分解产物使DNA大量破坏，导致神经细胞凋亡或死亡、抑制黑质细胞线粒体复合酶I等因素有关〔6〕。
　　
　　同时本实验发现各时间点小剂量Ldopa（10 mg·kg-1·d-1）治疗组PD大鼠Hcy和叶酸浓度较对照组无明显变化，而中、大剂量Ldopa治疗组PD大鼠Hcy浓度随Ldopa剂量增加而升高，叶酸浓度随Ldopa使用时间、剂量增加而降低，与王红梅等的结果一致〔7〕。Ldopa引起Hcy的水平升高的机制为：通过儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol Omethyltransferase，COMT) 氧位甲基化分解为3氧甲基多巴(3Omethyldopa，3OMD)，腺苷蛋氨酸作为甲基的提供者并产生S腺苷高半胱氨酸(Sadenosylhomocysteine，SAH)，SAH迅速的转化Hcy。实验证明Ldopa能明显提高血浆中Hcy的浓度，同时在脑组织及外周能显著降低腺苷蛋氨酸并升高SAH〔8〕。代谢过程中消耗叶酸，使得叶酸浓度降低。

　　Hcy的升高可以引起认知的缺损及痴呆，始于1978年的前瞻性研究表明，Hcy的对数值每增加1 SD，痴呆的多变数调整危险性为1.4，当血浆Hcy＞14 μmol/L时，PD的危险性几乎成倍增加〔9〕。在80年代中期，已有许多研究发现阿尔茨海默样痴呆及其他痴呆伴低维生素B12和/或叶酸以及Hcy显著升高〔10〕。本实验证明，学习记忆能力下降伴随着Hcy的升高，其间必然有一定的联系，Hcy可能通过促进兴奋性毒性及钙的细胞毒作用，促进氧化应激，促进能量消耗，损伤线粒体功能，以及加速细胞凋亡等促进海马和皮层神经元的损伤，从而促进学习记忆能力的下降的发生。通过本实验可以得出结论：长期大量使用Ldopa能使PD大鼠学习记忆能力明显下降，引起海马区病理学改变，其机制可能是升高Hcy。

参考文献

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