解除颈动脉狭窄联合Rho激酶抑制剂干预对大鼠轻度认知功能障碍的影响

作者：冉昌丽 李耀彩 张其梅 张强

【摘要】 目的 观察解除颈动脉狭窄联合Rho激酶抑制剂(RKI)治疗对轻度认知功能障碍（MCI）氧化损伤的影响和其认知功能的改变。方法 用 SD大鼠制作重度颈动脉狭窄模型，将其随机分成4组：联合组、药物组、狭窄解除组、对照组，每组6只。联合组在颈动脉狭窄模型建立2 w后，给予狭窄解除和法舒地尔腹腔注射给药8.35 mg/kg，药物组注射等量的法舒地尔，狭窄解除组给予解除狭窄，对照组注射等容积的生理盐水。假手术组只暴露颈总动脉但不结扎，不做任何处理。分别在2、4 w后用Morris水迷宫行为学检测对大鼠的认知功能进行评价，分光光度法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的含量，取颈动脉狭窄处比较狭窄解除前后颈动脉横截面积狭窄率的变化。结果 联合治疗组大鼠的逃避潜伏期和平台象限游泳距离占总游泳距离百分比与单纯药物组或狭窄解除组比较有显著改善(P<0.05)，且治疗4 w比2 w效果更明显(P<0.05)。与相应时相点的药物组或狭窄解除组比较，联合治疗组SOD的活性明显增加（P<0.05），MDA的含量明显降低（P<0.05），联合治疗4 w与2 w相比，变化更显著（P<0.05）。狭窄解除后与解除前比较狭窄率明显下降(P<0.01)，治疗4 w与2 w比较，差异显著（P<0.01）。结论 联合治疗可改善大鼠的MCI，其机制可能与增加SOD的活性，降低MDA的含量有关，其效果明显优于单纯的药物治疗或解除狭窄治疗，并且随着治疗时间的延长，疗效越好。

【关键词】 Rho激酶；轻度认知功能障碍；氧化损伤；法舒地尔

　　轻度认知功能障碍（MCI），即介于正常衰老和轻度痴呆间的过渡认知功能状态〔1〕。对MCI早期诊断和有效干预可能防止阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆的发生。Laszlo等〔2〕研究表明，颈动脉狭窄可以作为独立危险因素导致MCI，其机制主要是通过低灌注引起神经细胞氧化损伤而导致。Lin等〔3〕实验研究表明Rho激酶抑制剂(RKI)通过抗氧化作用从而改善慢性脑缺血引起的MCI。段炜等〔4〕实验研究表明，解除颈动脉狭窄对MCI有显著的治疗作用，但采用单纯的颈动脉支架置入(SP）术改善颈动脉狭窄引起的MCI，会引发一些并发症，尤其是术后再狭窄问题。因此，本实验利用大鼠重度颈动脉狭窄，制作MCI模型，研究解除狭窄联合RKI对大鼠认知功能和自由基水平的影响，旨为慢性脑缺血导致的MCI防治提供新手段。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司，批号：081206），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所），Morris水迷宫实验装置（成都研制），多功能显微镜及图像分析系统（德国Leica公司），健康雄性SD大鼠，（250±25）g，由同济医学院实验动物中心提供。

　　1.2 建立重度颈动脉狭窄大鼠模型

　　健康雄性SD大鼠30只，参照周振华等〔5〕的可控程度颈动脉狭窄动物模型制作方法并加以改进用“针控线栓法”建立。术前将手术缝线用地塞米松浸泡10 min，大鼠乙醚麻醉后固定，行颈正中切口，分离皮肤和肌肉并游离双侧的颈总动脉，在颈总动脉近心侧距颈内动脉和颈外动脉分叉处约0.5 cm处用0号手术缝线将直径为0.45 mm注射器针头和颈总动脉一起扎紧打成活结，留置线头，然后小心拔出针头，局部滴少量地塞米松，同时少量青霉素(溶于生理盐水中)滴于术野中，缝合伤口。假手术组只暴露双侧颈总动脉但不结扎，其余处理同模型组大鼠。大鼠重度狭窄颈动脉面积狭窄率为 70％～99％。

　　1.3 动物分组与处理

　　重度颈动脉狭窄模型随机分成4组：药物治疗组：成模2 w后大鼠每次按8.35 mg/kg法舒地尔悬浮于生理盐水中腹腔给药，2次/d，连续2、4 w；狭窄解除组：成模2 w后将大鼠再次用乙醚麻醉后固定，行颈正中切口，分离皮下组织和肌肉后找到双侧颈总动脉留置的结扎线头，将线头完全游离，并打开活结，然后小心的抽出缝线，狭窄解除持续2、4 w；联合治疗组：成模2 w后给予狭窄解除和法舒地尔联合治疗，持续2、4 w；对照组：大鼠每天均给予等量的生理盐水；假手术组不予任何处理。每组各6只。

　　1.4 颈总动脉狭窄处管腔横截面积狭窄率的测定

　　大鼠用过量水合氯醛麻醉，分离双侧颈总动脉，用 4％多聚甲醛灌注固定后截取颈总动脉狭窄处做横截面切片，取狭窄处前后各 3 个切面分析，输入计算机图像分析系统，分别计算每个切面的面积狭窄率并取平均值。狭窄率＝〔1-S1/S2〕×100%(S1、S2分别代表狭窄部分和正常血管相同部位横断面积)。

　　1.5 Morris水迷宫行为学检测

　　采用水迷宫实验装置及动态图像采集分析系统对各组大鼠进行评价。在各组大鼠给予相应干预措施前及其后2、4 w分别进行检测。水温控制在（26±1）℃，室温24℃～26℃，该实验分为定位航行试验和空间搜索实验两部分。

　　1.5.1 定位航行试验

　　历时5 d。第一天大鼠自由游泳2 min，使其适应环境和人的抓握等相关操作。从第2天起，分别从水池4个象限内将大鼠面向池壁放入水中，计算机监测并记录大鼠从入水开始寻找至找到并爬上透明平台的路线、所需时间(逃避潜伏期)等，即为一个训练程序，每个训练程序4次/只，每次训练间隔60 s，每天分上、下午各一个训练程序。如果大鼠2 min内未找到平台，这时潜伏期记为2 min。

　　1.5.2 空间搜索实验

　　历时1 d。定位航行试验后拆除透明平台，然后任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，并记录2 min内大鼠在各象限内游泳距离和大鼠搜索平台轨迹。

　　1.6 大鼠血清SOD和MDA的测定

　　将行认知功能检测后的大鼠用水合氯醛腹腔深麻醉，迅速从左心室抽取血液后离心，保留血清，放-20℃冰箱保存。SOD采用黄嘌呤氧化酶法；MDA采用硫代巴比妥酸法；然后应用紫外线分光光度计比色法记取吸光度值（OD值），测定SOD活性水平及MDA的含量。

　　1.7 统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件处理数据，数据以x±s表示，多种均数之间比较用单因素方差分析，两个均数比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠颈动脉狭窄处面积狭窄率的变化

　　在解除狭窄2、4 w后均发现狭窄解除组和联合治疗组大鼠颈动脉狭窄处面积狭窄率与治疗前比较均有显著差异(P<0.01)，与相应时相点的对照组比较也有明显差异(P<0.01)，而且随着颈动脉狭窄解除时间的延长，管腔横截面狭窄率逐渐下降，而药物治疗组与对照组比较无明显差异(P>0.05)。解除持续4 w后大鼠颈动脉管腔横截面狭窄率与2 w相比明显下降(P<0.01)。联合治疗组大鼠持续治疗2、4 w后的颈动脉管腔横截面狭窄率与同时相点的狭窄解除组或药物治疗组比较均明显下降(P<0.01)。见表1。表1 各组大鼠治疗前后颈动脉狭窄处面积狭窄率的变化(略)

　　2.2 各组大鼠水迷宫实验结果

　　对照组平均逃避潜伏期与假手术组比较明显延长(P<0.01)。分别治疗2、4 w后三种治疗组与治疗前比较均显著缩短(P<0.05)，并且与相对应时相点的对照组比较明显缩短(P<0.01)，治疗2 w时狭窄解除组与药物治疗组比较无明显差异(P>0.05)，而在治疗4 w时狭窄解除组减少更明显(P<0.05)，联合治疗组在治疗2、4 w后与单纯的药物治疗组和狭窄解除组比较有明显差异(P<0.05)。见表2。对照组平台象限游泳距离占总游泳距离的百分比与假手术组大鼠比较显著下降(P<0.01)。不同的治疗方式在治疗2、4 w后三种治疗组与治疗前比较明显增加(P<0.01)，并且与相对应时相点的对照组大鼠比较明显增加(P<0.01)。治疗2 w时狭窄解除组与药物治疗组比较无明显差异(P>0.05)，而在治疗4 w时狭窄解除组增加更明显(P<0.05)，联合治疗组在治疗2、4 w后与单纯的药物治疗组和狭窄解除组比较有明显增加(P<0.05)。见表3。表2 各组大鼠平均逃避潜伏期的变化(略)表3 各组大鼠平台象限游泳距离占总游泳距离百分比的变化(略)
　
　　2.3 各组大鼠血清SOD、MDA检测结果

　　治疗2 w后检测各组大鼠血清SOD的活性：假手术组和各治疗组与对照组比较有明显差异(P<0.01)；联合治疗组与狭窄解除组和药物治疗组比较有明显增加(P<0.05)；药物治疗组与狭窄解除组比较无明显差异(P>0.05)。治疗4 w后发现，假手术组和各治疗组与对照组比较仍明显高于对照组(P<0.01)；联合治疗组与狭窄解除组和药物治疗组比较仍明显增加(P<0.05)，联合治疗组和狭窄解除组治疗4 w明显高于治疗2 w（P<0.05）。见表4。表4 各组大鼠血清SOD检测（略）

　　治疗2 w后检测各组大鼠血清MDA活性：假手术组和各治疗组与对照组比较有明显差异(P<0.01)；联合治疗组与狭窄解除组和药物治疗组比较下降更明显(P<0.05)；药物治疗组与狭窄解除组比较无明显差异(P>0.05)。治疗4 w后发现，假手术组和各治疗组与对照组比较仍明显减低(P<0.01)；联合治疗组与狭窄解除组和药物治疗组比较下降更明显(P<0.05)，联合治疗组和狭窄解除组治疗4 w明显低于治疗2 w（P<0.05）。见表5。表5 大鼠血清MDA试验结果(略)

　　3 讨 论

　　氧化应激损伤在脑缺血后神经元损伤中起关键作用，有研究表明，慢性脑血流低灌注引起氧自由基的大量产生，导致脑实质和脑微血管系统的氧化损伤，从而引起认知功能障碍〔6〕。RKI具有神经保护及抗凋亡作用〔7，8〕，RKI可增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的形成，拮抗氧自由基，同时抑制细胞骨架蛋白的降解，起抗凋亡作用；在颈动脉狭窄引起的慢性脑缺血中，RKI法舒地尔对脑缺血后自由基代谢的影响及相关的一些治疗目前尚无深入研究。

　　Lin等〔3〕实验研究表明RKI羟基法舒地尔可以改善大鼠脑缺血引起的氧化损伤，即通过增加SOD活性和减少MDA含量实现。Evereklioglu等〔9〕也发现AD患者血浆中的MDA显著升高，其血浆和红细胞内SOD活性显著降低，并且伴有老年斑的AD患者血浆中的MDA水平与SOD活性负相关。

　　近年来许多临床研究显示颈动脉SP术后可以明显的改善脑血管病和颈动脉狭窄引起的认知功能障碍，但术后的各种并发症如血栓形成、脑缺血、再狭窄以及高灌注、低灌注等问题仍困扰着我们，尤其是SP术后再狭窄的问题严重阻碍了该技术的进一步发展。由于再狭窄与动脉粥样硬化有相似的病理学特点。因此，RKI也能抑制再狭窄形成〔10〕。法舒地尔不良反应少见，但单纯的药物治疗只是短期缓解临床症状，无法阻止病变进一步发展，因此本课题将RKI和解除狭窄联合起来治疗颈动脉狭窄引起的认知功能障碍，以便为临床治疗提供更好的治疗方案。

　　本实验说明法舒地尔、解除狭窄和联合治疗这三种措施都可以改善大鼠的认知功能障碍，而联合治疗改善更显著，联合治疗改善大鼠认知功能可能是通过抑制Rho激酶的活性而增加SOD活性与降低MDA含量来实现的。

　　综上所述，将解除狭窄联合RKI治疗颈动脉狭窄引起MCI的氧化损伤能有效地提高其治疗效果，是一种很有前景的治疗方法，并且为进一步研究颈动脉狭窄后MCI的机制提供了实验依据。

参考文献

　1 Burns A，Zaudig M.Mild cognitive impairment in older people〔J〕. Lancet，2002；360（9349）:19635.

　　2 Laszlo KS，Dezso N，Tamas S，et al.Carotid stenosis and the cognitive function〔J〕.J Neuro Sci，2009；283（1）：3640.

　　3 Huang L，He Z，Guo L，et al.Improvement of cognitive deficit and neuronal damage in rats with chronic cerebral ischemia via relative longterm inhibition of Rhokinase〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2008；28（5）:75768.

　　4 段 炜，陈康宁，柳春雨，等.解除颈动脉狭窄治疗轻度认知功能障碍的实验研究〔J〕.国际脑血管病杂志，2006；14（6）：4137.

　　5 周振华，陈康宁，周 宇，等.可控制狭窄程度的鼠颈动脉狭窄模型建立及认知功能改变〔J〕.中国临床康复，2005；8(28):60524.

　　6 Derdeyn CP.Videen TO，Fritsch SM，et al.Compensatory mechanisms for chronic cerebral hypoperfusion in patients with carotid occlusion〔J〕. Stroke，1999；30(5):101924.

　　7 Satoh S，Toshima Y，Ikegaki I，et al.Wide therapeutic time window for fasudil neuroprotection against ischemiainduced delayed neuronal death in gerbils〔J〕.Brain Res，2007；1128(1):17580.

　　8 Rikitake Y，Kim HH，Huang Z，et al.Inhibition of Rho kinase(ROCK)leads to increased cerebral blood flow and stroke protection〔J〕.Stroke，2005；36(10):22517.

　　9 Evereklioglu C，Er H，Doganay S，et al.Nitric oxide and lipid peroxidation are increased and associated with decreased antioxidant enzyme activities in patients with agerelated macular degeneration〔J〕.Doc Ophthalmol(S00124486)，2003；106(2):12936.

　　10 Matsumoto Y，Uwatoku T，Oi K，et al.Longterm inhibition of Rhokinase suppresses neointimal formation after stent implantation in porcine coronary arteries involvement of mutiple mechanisms〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004；24（1）:1816.