桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC823细胞株诱导凋亡作用和抗增殖的机制

　　　　作者：钟秀宏 孙东植 高宇 杨淑艳 崔基成

【摘要】 目的 探讨桦褐孔菌提取物在体外对人胃癌BGC823细胞株的诱导凋亡和抗增殖的作用机制。方法 应用TUNEL法和免疫细胞化学染色法检测桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC823细胞株的作用。结果 10～80 mg/L桦褐孔菌提取物作用人胃癌BGC823细胞株后，肿瘤细胞凋亡率与药物浓度正相关，Ki67阳性表达率随药物浓度的增加而减少，表现出浓度依赖性关系。80 mg/L桦褐孔菌提取物作用48 h后，bcl2基因蛋白的阳性表达率明显降低，而bax、caspase3基因蛋白阳性表达率明显升高。结论 桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC823细胞株有诱导凋亡和抗增殖作用，其诱导凋亡的分子生物学机制可能是通过下调bcl2和上调bax的表达，启动caspase凋亡信号实现的。

【关键词】 桦褐孔菌；胃肿瘤；细胞凋亡

　桦褐孔菌是一种主要生长在桦树上的药用真菌，属担子菌纲多孔菌科〔1〕。近年来，有关桦褐孔菌的化学成分、药理作用及机制研究方面都有新的报道〔2，3〕，特别是抗肿瘤作用引起俄罗斯、北欧、日本、美国及韩国等国家的相关学者的重视，为了探讨其抗肿瘤作用机制，本研究室在前期研究发现桦褐孔菌提取物对胃癌BGC823细胞株的增殖有抑制作用，并有明显的肿瘤细胞凋亡形态学改变〔4〕。为进一步探讨桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC823细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用及其机制，本研究室继续选用人胃癌BGC823细胞株，通过TUNEL法和免疫细胞化学染色法进行本项实验，以期对桦褐孔菌防治肿瘤有更深入认识。

　　1 材料与方法

　　1.1 胃癌细胞株与主要试剂

　　人低分化胃癌BGC823细胞株购自中科院上海细胞所。桦褐孔菌提取物由吉林省延边圣霖菌业有限公司提供。RPMI 1640培养基Gibco公司产品，无支原体胎牛血清为北京华美公司产品，胰蛋白酶为Difco公司产品，bcl2、bax及caspase3鼠抗人单克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品，Ki67工作液及免疫组化检测试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品。

　　1.2 体外细胞复苏与培养

　　人胃癌BGC823细胞株复苏后，用RPMI 1640培养基（含10％胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素)，在5%CO2，37℃条件下常规培养。胃癌细胞传代之旺盛，于实验前24 h半量换液，用4 g/L台盼蓝染色3 min，观察活细胞。本实验所用的活细胞均在98%以上。

　　1.3 实验分组及药物处理

　　将胃癌BGC823细胞株随机分为对照组及4个不同浓度桦褐孔菌提取物组。对照组培养液中加生理盐水，实验组分别给予10、20、40、80 mg/L桦褐孔菌提取物。

　　1.4 制作细胞爬片

　　将无菌的盖玻片置于6孔细胞培养板中，每孔1片，取对数生长期细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，再用含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液，稀释成1×108/ml，取0.5 ml细胞悬液滴加于盖玻片上，37℃，5%CO2及饱和湿度下孵育2 h，每孔加培养液2 ml，次日，每孔按实验分组药物处理，48 h后取出盖玻片，固定保存。

　　1.5 TUNEL染色法

　　取出盖玻片，实验操作按北京中山生物技术有限公司试剂说明书略加修正进行。染色后，在真彩病理细胞图像分析系统中求得凋亡细胞数。结果判定：在TUNEL染色中细胞凋亡阳性物质呈棕黄色，位于细胞核内，随机选取10个高倍镜视野，计算凋亡指数(AI)。

　　1.6 免疫细胞化学染色法

　　取出盖玻片，实验操作按SP试剂盒说明书略加修正进行。染色后，在真彩病理细胞图像分析系统中求得Ki67阳性细胞和bcl2、bax、caspase3阳性细胞数。结果判定：在免疫细胞化学染色中，阳性表达物质均呈棕黄色，Ki67、bcl2、bax、caspase3阳性反应为棕黄色，其中Ki67定位于细胞核内，部分细胞核分裂时显示出整个细胞的阳性反应。bcl2、bax定位于胞浆，也可见于胞膜和核膜，caspase3定位于胞浆。计算阳性表达率，随机选取10个高倍镜视野，计算阳性表达率（%)。

　　1.7 统计学处理

　　数据以x±s表示，利用SPSS11.0软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 TUNEL法检测药物对胃癌BGC823细胞株的诱导凋亡作用

　　经10～80 mg/L桦褐孔菌提取物作用于胃癌BGC823细胞株后，均能诱导肿瘤细胞凋亡，其AI分别为（6.57±0.92)%、（12.55±1.48)%、（18.96±2.28)%、（26.35±1.83)%，显示明显的量效关系，不同浓度之间的AI有显著性差异（P＜0.01)。

　　2.2 免疫细胞化学检测药物对胃癌BGC823细胞株的抗增殖作用

　　经10～80 mg/L桦褐孔菌提取物作用于胃癌BGC823细胞株后，其增殖指数分别为（92.68±1.74)%、（65.80±2.43)%、（53.96±3.23)%、（45.17±2.43)%、（35.10±8.58)%，Ki67阳性表达率随药物浓度的增高而降低，不同浓度之间均有显著性差异（P＜0.01)。

　　2.3 免疫细胞化学检测药物对胃癌BGC823细胞株的凋亡相关基因蛋白表达的影响

　　胃癌BGC823细胞株经80 mg/L桦褐孔菌提取物作用48 h后，与对照组相比，实验组bcl2基因蛋白阳性表达率明显下降，而bax、caspase3基因蛋白阳性表达率明显升高（P＜0.01)，见表1。表1 桦褐孔菌提取物对胃癌 BGC823细胞株凋亡相关基因蛋白表达率的影响(略)

　　3 讨 论

　　近年来，国内外研究报道，桦褐孔菌煎煮液能抑制小鼠移植肉瘤的生长〔5〕，水提取液在体外可抑制人子宫颈肿瘤细胞的生长，10～2 000 μg/ml的桦褐孔菌可抑制癌细胞生长〔6〕。国内也有报道，桦褐孔菌多糖对小鼠S180肉瘤有抑制作用〔7〕，桦褐孔菌提取物对人胃癌MGC803细胞株有抗增殖与诱导凋亡作用〔8〕。本研究在前期从形态学方面进行桦褐孔菌提取物对胃癌BGC823细胞株的诱导凋亡作用的基础上，进一步从生物化学和免疫细胞化学方面研究其抗增殖和诱导凋亡作用，并初步探讨其发生机制。本研究证实桦褐孔菌通过凋亡相关基因诱导肿瘤细胞凋亡的结果。

　　肿瘤细胞Ki67表达水平亦相应增高，因此被视为较可靠的全面反映细胞群体增生水平的指标〔9〕，Ki67表达与细胞周期有关。本实验结果提示桦褐孔菌的某些活性成分作用于胃癌细胞的基因调控来阻止癌细胞进入分裂期，从而抑制肿瘤细胞生长。

　　细胞凋亡是受基因调控的，其中bcl2是目前作用较明确的凋亡调控基因，它倾向于分布在生长细胞、增殖细胞。bcl2通过抑制诱导凋亡而使细胞寿命延长，细胞堆积，在肿瘤的发生中起始动作用。bcl2蛋白抑制线粒体膜的通透性和阻止细胞色素C的释放，先后抑制了caspase3依赖的级联反应，使细胞免于发生凋亡，bcl2的过量表达能有效地抑制各种因素所诱发的caspase3激活和凋亡〔10〕。bax基因则倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞。在功能上与bcl2相反，其过度表达则触发凋亡。bax是一个单体可溶性胞质因子，当凋亡诱导后，寡聚化、转移、插入线粒体外膜，在线粒体依赖性凋亡途径中还能通过其在线粒体外膜聚合形成离子通道的方式促进cytc等蛋白分子释放以引起细胞凋亡〔11〕，并可以通过增加caspases的活性来促进细胞的凋亡，也可以同抑凋亡基因bcl2相结合，从而对抗其阻止凋亡的功能。本实验结果表明，经80 mg/L桦褐孔菌提取物作用胃癌BGC823细胞株48 h后，抑制了bcl2蛋白的表达，促进了bax、caspase3蛋白的表达。说明桦褐孔菌诱导胃癌BGC823细胞株凋亡的分子机制，主要是通过下调抑凋亡基因bcl2蛋白表达和上调促凋亡基因bax蛋白表达，并且与启动caspase凋亡信号有关，关于胃癌细胞凋亡途径，有待进一步研究。

参考文献

　1 钟秀宏，孙东植.桦褐孔菌研究现状〔J〕.延边大学医学学报，2004；27（4)：31921.

　　2 Mazurkiewicz W.Analysis of aqueous extract of Inonotus obliquus〔J〕. Acta Pol Pharmal，2006;63(6):497501.

　　3 Kim YO，Park HW，Kim JH，et al.Anticancer effect and structural characterization of endopolysaccharide from cultivated mycelia of Inonotus obliquus〔J〕.Life Sci，2006;9(1)：72.

　　4 钟秀宏，孙东植，崔基成，等.桦褐孔菌提取物对人胃癌BGC823细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用〔J〕.延边大学医学学报，2006；29（2)：826.

　　5 Gorikowski T.Effect of decoction of Poria oblique on growth of transplanted Crocker′s sarcoma in mice〔J〕.Patol Pol，1955;6(4):2939.

　　6 Burczyk J，Gawron A，Slotwinska M，et al.Antimitotic activity of aqueous extracts of Inonotus obliquus〔J〕.Boll Chim Farm，1996;135(5):3069.

　　7 金 光，杨恩月，金晴昊，等.桦褐孔菌多糖的抗肿瘤的作用实验研究〔J〕.延边大学医学学报，2004；27（4)：2579.

　　8 李英秀，崔基成，孙东植，等.桦褐孔菌提取物对胃癌MGC803细胞株的抗增殖与诱导凋亡作用〔J〕.菌物研究，2003；1（1)：1723.

　　9 Bozlu M，Orhan D，Baltaci S，et al.The prognostic value of proliferating cell nuclear antigen，Ki67 and nuclear organizer region in transitional cell carcinoma of the bladder〔J〕.Int Urol Nephrol，2002;33(1):5966.

　　10 Granville DJ，Jiang H，An MT，et al. Bcl2 overexpression blocks Caspase activation and downstream apoptotic events investigated by photodynamic therapy〔J〕.Br J Cancer，1999;79(1):95100.

　　11 Shinoura N，Yoshida Y，Asai A，et al.Relative level of expression of Bax and Bclxl determines the cellular rate of apoptosis/necrosis inducing by the overexpression of Bax 〔J〕.Oncogene，1999;18(41):5703