理中丸含药血清对Cajal间质细胞的影响

　　　　　　作者：张丰华 黄秀深 罗明凤 孙改侠

【摘要】 探讨理中丸对Cajal间质细胞的作用。［方法］通过体外培养及血清药理学的方法，观察理中丸含药血清对Cajal间质细胞（ICC）Ca2+ATP酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活力的影响。［结果］理中丸含药血清能明显提高ICC细胞Ca2+ATP酶活力（P<0.01），使ICC细胞外Ca2+浓度提高（P<0.01）；并在明显提高ICC细胞内SDH活力的同时（P<0.01），降低ICC细胞内LDH活力（P<0.01）。［结论］理中丸含药血清能提高ICC细胞Ca2+ATP酶活力，同时还能增强ICC细胞内的有氧代谢，抑制细胞内的无氧代谢。

【关键词】 理中丸；Ca2+ATP酶；琥珀酸脱氢酶；乳酸脱氢酶

Abstract:［Objective］ To explore the effects of medicated serum of Lizhong Bolus on ICC. ［Methods］ To observe the regulatory effects of medicated serum of Lizhong Bolus on activity of Ca2+ATPase，SDH and LDH in ICC by the methods of culture in vitro and Serum Pharmacology. ［Result］The medicated serum of Lizhong Bolus could obviously improve the activity of Ca2+ATPase and SDH in ICC（P<0.01）as well as the extracellular Ca2+ concentration; and it could remarkably inhibit the activity of LDH（P<0.01）.［Conclusion］ The medicated serum of Lizhong Bolus could obviously improve the activity of Ca2+ATPase; and it could improve the aerobic metabolism and inhibit anaerobic metabolism in ICC.

　　Key words: Lizhong Bolus;Ca2+-ATPase; Succinate Dehydrogenase (SDH); Lactate Dehydrogenase (LDH)

　　理中丸方出《伤寒论》，具有温中祛寒、补气键脾之功，乃为温补脾土之名方。Cajal间质细胞（ICC）是近年来胃肠道研究的一个热点。本项研究探讨理中丸对ICC细胞Ca2+ATP酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活力的影响，从而为全面揭示理中丸作用机制提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 ICC的培养和鉴定

　　昆明株小鼠，雌雄不拘，出生后15天左右。由成都中医药大学实验动物研究中心提供。小鼠禁食12h后，在无菌条件下，取距离回盲部10cm的小肠，放入培养皿，剥去小肠系膜和血管，用PBS(pH7.0)在50ml小烧杯中将小肠内容物冲洗干净后，将小肠用2ml注射器针头纵行剖开小肠，剥去小肠黏膜层，PBS反复冲洗肌条3～4次，将肌条剪碎至1～2mm3小块后放入小烧杯中，加入Ⅱ型胶原酶(1.3mg/ml)，37℃消化30min，消化好后通过200目筛网滤去大块组织，将含细胞的滤液移入10ml离心管，1500rpm离心3min，去上清，加入用M199重悬沉淀，用吸管反复吹打约，1500rpm离心3min，去上清，再加M199重悬细胞，，将细胞加在等体积Ficoll400梯度密度液上，3000rpm离心10min，取液面交界细胞沉淀［1］。

　　用M199培养基，将细胞浓度调整至1×106/ml，接种至6孔培养板，板中预先放置包被鼠尾胶原(2ng/cm2)的盖玻片。放入培养箱内，在37℃，5%CO2条件下培养。

　　细胞培养24h后换液，冲去未贴壁细胞，加入培养基继续培养，以后每3～4d换液1次，期间用倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞稳定培养7d后，进行免荧光检测以确定是否为ICC细胞。

　　1.2 理中丸含药血清制备及给药

　　SD大鼠20只，雌雄各半，随机分为两组，10只/组：理中丸组与阴性对照组。理中丸组灌胃理中汤(10ml/kg)，共3天；阴性对照组则相应灌胃相应体积的生理盐水。第三天灌胃1h后取血，血在室温下静置几小时后，离心，取上清。然后56℃，30min灭活；过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。细胞给药血清浓度均为15%，48h后检测指标。

　　1.3 试剂

　　M199培养基（Gibco），SCF（Peprotech），Ⅱ型胶原酶(Gibco)，大鼠抗小鼠ckit抗体（武汉博士德），羊抗大鼠FITC标记荧光抗体（Vector），Ficoll400（Pharmacia）；Ca2+ATP酶测定试剂盒(批号20080620)、钙测定试剂盒(批号20080624)、LDH测定试剂盒(批号20080620)、SDH测定试剂盒(批号20080624)均购置南京建成生物工程研究所。

　　1.4 样本制备及指标测定

　　细胞加药48h后将细胞制成细胞悬液移入离心管，以1500rpm 15min，弃上清夜。生理盐水洗3次。弃上清夜，加入200ul生理盐水，手动匀浆机破碎细胞。然后严格按照各指标测定试剂盒说明操作。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据都以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用SPSS13.0统计软件处理数据进行t检验。

　　2 结果

　　2.1 理中丸含药血清对ICC细胞Ca2+ATP酶及细胞外Ca2+浓度的影响

　　表1（表1 理中丸对ICC Ca2+ATP酶及胞外［Ca2+］的影响(略）与阴性对照组比较，*P<0.01）．结果提示：理中丸含药血清能提高ICC细胞Ca2+ATP酶活力和细胞外Ca2+浓度（P<0.01）。

　　2.2 理中丸含药血清对正常ICC细胞内SDH/LDH活力的影响

　　表2（表2 理中丸对ICC SDH/LDH活力的影响 (略）与阴性对照组比较，*P<0.01）．结果提示：理中丸含药血清均能提高ICC细胞内SDH活力（P<0.01）；并能降低ICC细胞内LDH活力（P<0.01）。

　　3 讨论

　　ICC作为胃肠道的慢波起源细胞，其减少和损伤在胃肠动力类疾病中非常常见，与胃肠动力障碍性疾病关系密切。临床上理中丸在治疗很多胃肠动力障碍性疾病疗效显著。

　　Ca2+ATP酶的主要功能是释放和存储细胞内钙，维持细胞内Ca2+稳态。Ca2+是一种细胞内信使，在肌肉细胞，Ca2+能触发肌肉收缩，在很多分泌细胞包括神经细胞，Ca2+能触发分泌活动。另外，Ca2+信号系统还能参与调节细胞分裂、细胞凋亡等。本研究提示，理中丸含药血清可以提高ICC细胞Ca2+ATP酶活力，从而提高细胞外Ca2+浓度，这对维持ICC细胞内低钙水平，恢复其兴奋性是重要的。

　　乳酸脱氢酶（LDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）均是细胞代谢反应中最基本的酶系， LDH是一种主要的无氧酵解酶，也是糖酵解过程中的重要酶，其主要作用是催化丙酮酸与乳酸间反应。本研究提示，理中丸含药血清能增强ICC细胞内的有氧代谢，抑制细胞内的无氧代谢，这可能是理中丸恢复胃肠功能的一个重要机制。

参考文献