【摘要】 探讨冰片联合顺铂对大鼠C6胶质细胞瘤的治疗作用。［方法］建立大鼠C6胶质瘤细胞模型，于治疗组给予灌服冰片及静脉注射顺铂，21天后分析治疗组与对照组胶质瘤横截面积。［结果］治疗组脑胶质瘤的横截面面积明显小于对照各组（P<0.05）。［结论］冰片能增加血脑屏障对顺铂的通透性，从而提高顺铂对胶质细胞瘤的治疗作用。
【关键词】 冰片；顺铂；大鼠C6胶质瘤细胞模型；血脑屏障
Abstract:［Objective］ To explore the treatment of rat cell line C6 brain glioma model with borneol and cisplatin.［Methods］ Prepare the rat cell line C6 brain glioma model，the treated group received oral borneo1 and intravenous infusion of Cisplatin ，the area of treated group and control groups were analyzed after 21 days. ［Results］ The mean area reduced significantly（P<0.05）compared with those of the control groups. ［Conclusion］ Borneol can enhance the permeability of blood—brain barrier to cisplatin，and increase the treatment of brain glioma with cisplatin.
Key words:borneol;cisplatin; rat cell line C6 brain glioma model; blood—brain barrier
顺式二氯二氨合铂(顺铂，Cisplatin ，DDP)是20世纪70年代上市的在临床上有高度抗癌活性的药物，对于脑癌、鼻咽癌、肺癌等均有良好疗效。血脑屏障(BBB)是一个介于血液和脑脊液之间、有选择性通过能力的动态界面，对于保持脑内环境的相对稳定具有十分重要作用。由于血脑屏障的保护作用，静脉注射的顺铂难以直接进入脑组织而发挥疗效。合成冰片是外消旋龙脑的混合物，同时也是常用的开窍药和佐使药，具有“芳香走窜、引药上行”之功效。研究发现，冰片有改善BBB通透性，促进其他物质透过BBB进入脑组织的作用，且能提高其他药物的血药浓度和生物利用度［12］。本实验研究中，我们旨在探讨应用冰片促进顺铂透过血脑屏障对大鼠C6胶质细胞瘤治疗的可行性，为研制新型抗脑肿瘤药物提供理论依据。
1 材料
1.1 细胞系和试剂
C6细胞株购于中科院上海细胞生物学研究所细胞库；医用顺铂，20mg/瓶，齐鲁制药；石蜡油，500ml/瓶，南昌白云制药；冰片，购于杭州胡庆余堂；250ml生理盐水5瓶，杭州民生药业；小牛血清购于杭州四季青胰蛋白酶及培养基购于GIBCO公司10％水合氯醛(自配)：以3ml/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠；
1.2 仪器设备和器械
细胞培养系统：Thermo Scientific CRS自动化细胞培养系统；超净工作台：江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产；江湾I型大鼠脑立体定向仪：第二军医大学生产。
1.3 实验动物
40只雄性Wistar大鼠购于上海实验动物中心，体重300～320g。
2 方法
2.1 细胞培养
将C6细胞分装于数只75cm2(底面积)的培养瓶中。加入适量含有体积分数为10％小牛血清的RPMI1640培养液，置入温度37℃、CO25％的培养箱中培养。在细胞处于指数生长期时，以胰蛋白酶适量消化3～5min后，弃去消化液。用Hanks液吹打冲洗1～2次形成细胞悬液，调细胞浓度为每10μl含1.5×106个C6细胞的悬液用于接种。
2.2 颅内接种
将麻醉后的大鼠头部固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，碘伏消毒后铺洞巾。取内眦连线与头部正中矢状面交点向后纵向切开头皮约1cm，分离暴露颅骨。根据Batker法确定右尾状核靶点，于冠状缝前1mm，中线右旁开3mm，以牙科钻在颅骨上钻孔，孔径约1.2mm，深达硬脑膜表面而不伤及脑组织。25μl微量注射器抽取C6细胞悬液10μl，沿骨孔缓慢匀速注射10min，注射完毕后留针5min，缓慢退针，骨孔用医用明胶海绵填充，骨蜡封闭。生理盐水冲洗手术区，无菌丝线缝合切口后消毒皮肤，术后加用青霉素抗感染，整个过程在层流超净台中进行，麻醉复苏后单笼常规饲养14天。
2.3 实验分组
将40只大鼠随机分为冰片＋顺铂治疗组；单用顺铂组；冰片组；空白对照组，共4组，每组10只。
2.4 大鼠体内治疗实验
于术后14天，实验组：灌服10％的冰片石蜡油溶液（m/v）3ml/kg/次，1h后大鼠尾静脉注射顺铂1μg/g，以后每48h给同等剂量冰片+顺铂1次，共计3次。冰片组单用冰片石蜡油溶液。空白对照组则采用同体积石蜡油溶液，无冰片组则未加冰片，其余方法相同。
2.5 试验纪录
①观察大鼠活动状态。②肿瘤最大横径测量。于肿瘤接种21天取大鼠全脑，10%甲醛溶液固定后沿肿瘤中心作冠状切面，水平方向测量每个肿瘤最大横截面面积(包括坏死等病变组织)。③组织病理学检查：所有脑标本固定，脱水，常规石蜡切片，片厚4μm，HE染色，光镜下观察。
2.6 数据统计
统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行LSD检验分析。
3 结果
3.1 各组大鼠于肿瘤接种成功后均于恒温台上复苏，复苏时间2～4h不等。复苏之后的大鼠逐渐恢复正常的饮食活动等。各组大鼠于肿瘤接种后10天起出现皮毛不洁、饮食变差等异常现象，实验组于给予顺铂治疗后症状改善情况明显好于对照的三组大鼠。
3.2 各组脑胶质瘤的平均横截面面积比较
见表1。表1 脑胶质瘤的平均横截面面积治疗组与对照组（略）．与对照组相比，*P<0.05C6胶质细胞瘤病理切片，见图1。
4 讨论
血脑屏障(BloodBrain Barriar，BBB)是存在于脊椎动物的血液循环与神经系统之间一层细胞屏障，起到保护中枢神经系统、维持脑内外环境稳定的作用。冰片为龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品或菊科植物艾纳香叶提取的结晶［3］，或以樟脑、松节油等为原料，经化学方法合成的精制品。冰片味辛、苦，微寒。归心、脾、肺经，《本草纲目》记载：冰片具“通诸窍、散郁火”之功。
研究显示，冰片能可逆性开启BBB，作为“佐使药”协助其他药物透过BBB。本实验研究发现，大白鼠灌服10%冰片石蜡油溶液及尾静脉注射顺铂后，实验组脑胶质瘤的横截面面积明显小于对照各组（P<0.05），具有统计学差异。这些均提示，冰片具有促进顺铂进入脑组织的作用，其结果与贾钰铭等［4］相关研究基本一致。
本研究结果，可以说明冰片促BBB开放与脑炎、脑外伤的病理性开放有质的区别，其开放为生理性开放，冰片对脑及BBB有一定的保护作用，其促血脑屏障开放不会引起脑的病理性损害。也有学者研究发现［5］，冰片对大鼠下丘脑单胺类神经递质含量有影响，冰片对大鼠下丘脑肾上腺素的含量与对照组相比有下降趋势，提示冰片可能通过改变下丘脑单胺类神经递质的含量调节中枢神经系统的功能。
参考文献
1］Dong XZ，Tang XA，Gao QH，et al.Study on the auxoaclion of Borneol assisting the penetration of DDB across BBB［J］.Chin Pharm， 2002，37(4)：75.
［2］Wu SR，Cheng G，He YX，et al.Studies on the effects of borneol on the distribution of rifampicin in mice［J］.Chin Pharm， 2004，39(4)：288291.
［3］刘庆华，刘彦辰.实用植物本草［M］.天津：天津科学技术出版社，1998.
［4］贾钰铭，丁正，曾令源.冰片促进顺铂透过血脑屏障的实验研究［M］.四川医学，2004，25(2)：156157.
［5］Yuan Z，Zhang JP，Liu YF，et al.The relationship between P—gt and borneol induced physical opening of blood—brain barrier［J］.Tianjin Tradit Chin Med，2006，40(3)：261262.