【关键词】 大鼠
【关键词】 血管内皮生长因子受体3；血管；胚胎
1材料和方法
15只成熟Wistar大鼠由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供，体质量180~230 g. 实验当天下午5:00将未孕雌鼠与雄鼠合笼，次日早晨进行雌鼠阴道涂片光镜观察，将涂片上观察到大鼠精子的当天记为妊娠第1日. 取第15日胚胎31只，第21日胚胎30只，生后7 d幼鼠28只. 取胚胎躯干背部皮肤组织，40 mg/L多聚甲醛固定12 h，常规石蜡包埋，切片厚4 μm，60℃烤片2 h，进行免疫组化染色. 多克隆兔抗鼠VEGFR3抗体为Santa Cruz公司产品；SABC免疫组化试剂盒、3氨基9乙基咔唑（3amino9ethyl carbazole， AEC）显色系统均购自武汉博士德生物工程有限公司. 采用SABC法，石蜡切片常规脱蜡至水，30 mL/L过氧化氢－甲醇封闭15 min；抗原修复采用0.1 mol /L枸橼酸缓冲液水浴加热（92~95℃） 15 min，置于室温40 min；正常山羊血清封闭20 min；滴加VEGFR3一抗(1∶200)，湿盒中孵育，4℃过夜；磷酸缓冲液(PBS pH 7.4)冲洗，滴加生物素化羊抗兔二抗，室温30 min；SABC工作液室温30 min；PBS冲洗，AEC显色，显微镜下控制显色时间；苏木素复染，水性封片剂封片.
2结果
光镜下可见血管管壁较厚，血管管腔形状不规则，VEGFR3免疫反应阳性物质位于皮肤血管内皮细胞内，为红色颗粒. 第15日胚胎和第21日胚胎血管VEGFR3阳性颗粒颜色较深，部分可覆盖内皮细胞胞核；出生后7 d幼鼠皮肤血管VEGFR3染色与胚胎阶段相比颜色明显变淡，染色颗粒明显减少，阴性对照未见血管内皮免疫反应阳性信号.第15日胚胎皮肤组织中，31例血管内皮VEGFR3染色阳性者15例，阳性率是48.4%；第21日胚胎皮肤组织中，血管内皮VEGFR3染色阳性率为46.7%(14/30)；生后7 d幼鼠皮肤组织中，血管内皮VEGFR3染色阳性率为21.4%(6/28). 从胚胎发育不同阶段的血管内皮VEGFR3阳性表达变化可见生后7 d血管内皮VEGFR3的表达水平明显低于胚胎第21日和胚胎第15日的表达水平(P&<0.05)，血管内皮表达VEGFR3蛋白的水平随着胚胎的发育逐渐下降趋势（表1）.
表1胚胎发育不同时期血管内皮VEGFR3的表达(略) 3讨论
VEGFR3 是从人类红白血病细胞以及胎盘cDNA文库中克隆而来的，血管内皮生长因子家族中成员VEGFC可通过与VEGFR3结合而促进血管和淋巴管的发生和发育［1-2］. VEGFR3的表达具有时间特异性，在小鼠胚胎第8.5日，在心血管、头部间充质的成血管细胞可见到VEGFR3 mRNA的表达；在胚胎第11.5~12.5 d，VEGFR3主要在发育中的静脉以及淋巴管内皮细胞中表达，在动脉内皮细胞表达微弱；在胚胎第14.5日时，VEGFR3已经仅仅局限在淋巴管内皮细胞和一些高内皮静脉表达［3］，敲除VEGFR3基因的胚胎死于孕中期循环系统的发育不全，这些结果表明VEGFR3在脉管系统的发育中起重要的作用［4］. 我们在实验中观察到，在大鼠胚胎第15日和第21日皮肤血管内皮均阳性表达VEGFR3蛋白，出生后7 d仍可见血管内皮阳性表达VEGFR3，只是随着胚胎的发育VEGFR3在血管内皮的表达表现为下降的趋势，VEGFR3在胚胎血管的持续表达说明其在胚胎血管的发育中起着非常关键的作用，VEGFR3介导胚胎血管发生的作用是一个逐渐变弱的过程，从血管发生开始一直持续到血管发育成熟为止，此后，VEGFR3的主要作用是维持淋巴管的结构和功能.
参考文献
［1］ Veikkola T， Alitalo K. VEGFs receptors and angiogenesis［J］. Semin Cancer Biol， 1999，9(3):211-220.
［2］ Jussila L， Alitalo K. Vascular growth factors and lymphangiogenesis［J］. Physrev， 2002，82 (3):673-700.
［3］ Valtola R， Salven P， Heikkila P， et al. VEGFR3 and its ligand VEGFC are associated with angiogenesis in breast cancer［J］. Am J Pathol， 1999，154(5):1381-1390.
［4］ Dumont DJ， Jussila L， Taipale J， et al. Cardiovascular failure in mouse embryos deficient in VEGF receptor3［J］. Science， 1998，282(5390):946-949.