关于提取成熟骨组织总RNA的新方法

作者：温冬青，赵锦荣，孔亚林，郭慧芳，阎小君

【关键词】 骨组织；总RNA；基因表达
　　【关键词】 骨组织；总RNA；基因表达
　　1材料和方法
　　1．1材料取三组正常成年SD大鼠股骨，以下用XHF1型高速离散器按文献操作［1］.
　　1．2方法选取三种提取总RNA的方法，即：A-按Trizol说明书进行；B-同A，其中氯仿抽提重复2次；C-同A，产物以DNA酶消化后再加Trizol重复A. 对结果进行RTPCR验证，各取等质量RNA按Invitrogen说明书进行反转录，得到的cDNA进行I型胶原的PCR扩增. 根据I型胶原的mRNA序列用DNAStar软件设计引物5’CTCAGGGGCGAAGGCAACAGT3’和5’ATGGGCAGGCGGGAGGTCT3’. 设计时使扩增片段跨内含子，即基因扩增产物和cDNA扩增产物在长度上相差内含子序列，cDNA长度125 bp，实际基因长度255 bp. 2 g/L琼脂糖凝胶电泳查看结果.
　　2结果
　　各方法所得总RNA的A260 nm，A280 nm及A260 nm／A280 nm值有一定差异，前两法各值相近，实验观察到两法得到的总RNA溶液较浑浊，杂质的存在使A260 nm／A280 nm低于标准值. 各法均有扩增条带（图1，2），但前两法产物中有大量较长杂质片断（图1）. 只有C法符合进一步克隆表达要求.
　　M：DL2000 marker；1~3： A组； 4~6： B组； 7：对照.
　　图1I型胶原粗品RNA的扩增产物（略）
　　M：DL2000 marker；1~3： C组； 4：对照.
　　图2I型胶原mRNA的扩增产物（略）
　　3讨论
　　高速分散器可使大部分骨细胞在短时间内从钙盐中分离出来，节省操作时间、简化操作过程，与已往方法［2］比减少RNA降解几率. 但分散器也将DNA长链打断而混入RNA分子中，即使用氯仿重复抽提也不能去除. 若完全按Trizol法不进行DNA消化，会漏除已碎裂的小片段DNA，进而导致扩增出含有内含子的较长片段.
　　本文对TRIZOL法从成熟大鼠骨组织提取总RNA作了两种改进，只有重复2次抽提之间用DNA酶消化，才能在清除大量细胞外基质和矿物质干扰的同时保证所提RNA完整且纯净.
　　【参考文献】
　　［1］ 李丁，苏海川，赵锦荣，等. 骨组织总RNA的提取［J］. 第四军医大学学报， 1999， 20（12）:1056.
　　［2］ Nemeth GG，　Heydemann A， Bolander ME. Isolation and analysis of ribonucleic acids from skeletal tissues［J］. Anal Biochem，1989，183(2): 301-304.转贴于