【关键词】 缺血 再灌注 星形胶质细胞 经元 胶质纤维酸性蛋白 原癌基因
Abstract： Objective To study the changes in the expressions of astrocytes glial fibrillary acidic protein (GFAP) and neuronal c-fos expression after reperfusion of focal cerebral ischemia in rats. Methods Seventy male rats were pided into one sham group and seven ischemia groups， which were reperfused for 2， 4， 6， 12， 24， 48 and 72 h respectively. Immunohistochemical single staining and Western blot method were used to study the time course of separate expressions of c-fos and GFAP in the cerebral cortex after the middle cerebral artery occlusion/reperfusion. The immunohistochemical double staining method was applied to investigate the relation between GFAP and c-fos after 4， 24 and 48 h of reperfusion. Results Significant increase of c-fos expression was observed at 2 h of reperfusion， peak value was reached at 4 h (P&<0.05). The astrocytes were activated at 4 h， with the GFAP expression increasing and approaching its peak value at 48 h， and then beginning to decline. The difference in GFAP expression between the two groups were significant at all time points (P&<0.05). c-fos positive neurons surrounded by GFAP positive astrocytes were located in the ischemic cortex. Conclusion The expressions of astrocytic GFAP and neuronal c-fos are both activated in the ischemic cortex and proceed along a time course of regular pattern.
Key words: ischemia/reperfusion; astrocyte; neuron; glial fibrillary acidic protein; proto-oncogene
缺血性脑血管病的发病机制一直是人们研究的重点。近年来随着对星形胶质细胞认识的深入，人们发现通过离子流、神经递质和粘附分子等途径，神经元和星形胶质细胞之间可以互相影响［1-2］。在脑缺血等病理状态下它们相互作用关系如何也就日渐引起了人们的重视。在脑缺血等病理情况下，星形胶质细胞在神经系统可塑性变化方面可发挥重要作用，其通过兴奋性氨基酸释放和重摄取、自由基清除等多途径影响神经元的存活［3］。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)是星形胶质细胞中间丝蛋白的主要成分之一，当细胞受到刺激时，GFAP的表达将发生变化［4］。c-fos为原癌基因，正常生理状态下，在神经细胞中仅呈极低水平表达， 起到参与信息传递的作用。在中枢神经系统受损等外界刺激下， c-fos基因能迅速作出反应，于相应受损区域神经细胞中出现不同程度的表达增高，故能较敏感地反映神经细胞功能状态。有研究证实c-fos的表达与脑缺血后神经细胞中信息的传递乃至其生存或死亡均有密切关系。对在体脑缺血动物模型中非神经元细胞的应激反应及其信息调控的报道甚少，本实验观察了MCAO大鼠缺血脑皮质星形胶质细胞GFAP及神经元c-fos的表达时程变化，以期探讨在脑缺血/再灌注时星形胶质细胞的变化及其与神经元的关系，研究它们在脑缺血中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组 体重220～250 g成年雄性Sprague-Dawley大鼠70只(徐州医学院实验动物中心提供)，随机分为缺血组（n=56）及假手术组(n=14)，其中缺血组根据再灌注后取材时间分为再灌注2、4、6、12、24、48、72 h 7个亚组，每亚组8只大鼠。
1.2 动物模型的制备 参照Longa等［5］的线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型。动物饲养及手术室温度控制在25℃左右，术前12 h禁食不禁水。将大鼠以35 mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，于颈内动脉远心端备线，在颈总动脉近分叉处剪一约0.2 mm 的“V”形切口，将预先经多聚赖氨酸及肝素处理过的直径为0.24 mm的尼龙渔线经该切口顺颈总动脉插入颈内动脉(18±1) mm，感到有轻微阻力时停止，使大脑中动脉起始部阻塞。扎紧备线并固定线栓，缝合皮肤切口，2 h后将线栓拔出约10 mm，恢复再灌注。麻醉清醒后观察出现右侧Horner综合征、左侧前肢为主的活动障碍后为模型制备成功。假手术组条件同上，置线栓深度为10 mm。
1.3 免疫组化组织材料准备 各组中一半动物用过量10%水合氯醛(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸经左心室至升主动脉插管，先以150 ml生理盐水冲洗血液，随后以4℃的含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS先快后慢灌流固定2 h后取脑，切取视交叉前2 mm至视交叉后2 mm脑组织，脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片，片厚4 μm，捞片，分套备用。
1.4 Western blot材料的准备 余下一半动物用过量10%水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，于冰面上分离切取右侧半球视交叉前2 mm至视交叉后2 mm脑组织，液氮迅速冷冻，-70℃保存待用。
1.5 免疫组织化学染色 切片分套染色，脱蜡至水，高压抗原修复，第1套切片放入3% h3O2溶液中室温浸泡15 min后，5%牛血清白蛋白封闭30 min后依次入:①兔抗c-fos抗体稀释液(1∶400，Sigma公司) ，4℃过夜；②生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500，Sigma)，室温孵育2～4 h；③生物素-卵白素-HRP复合物(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1 h。DAB-h3O2显色。以上每一步骤之后均用0.01 mol/L PBS液充分漂洗3次，每次5 min(下同) 。第2套切片行抗GFAP（小鼠源，1∶200，Santa Cruz公司）染色，步骤如上。第3套切片中挑取4、24、48 h切片行GFAP及c-fos双重染色，步骤为先行GFAP的DAB染色，然后重新封闭，入一抗c-fos，碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG（1∶100，Santa Cruz公司），NBT-BCIP显色。结束染色的切片经漂洗后晾干、脱水、透明、封固。光镜下观察缺血侧皮质区，取每组4只大鼠8张单标切片40个100倍视野，对c-fos阳性神经元及GFAP阳性星形胶质细胞进行计数。
阴性对照实验：取对应时间点切片，用0.01 mol/L PBS分别替代抗c-fos、抗GFAP抗体按上述方法进行免疫组化染色，结果为阴性。
1.6 Western blot法测定脑组织的GFAP及c-fos表达 取脑组织匀浆，离心提取总蛋白，煮沸变性。制备SDS-PAGE凝胶，加样电泳，待溴酚蓝电泳至分离胶底部时结束电泳。采用湿转法转膜，将醋酸纤维素膜（NC膜）浸入含10%的脱脂奶粉的TBST的封闭液中，置于水平摇床上，室温封闭4 h，将NC膜加入稀释的c-fos抗体(兔抗大鼠，1∶500，Sigma公司)及GFAP抗体 (小鼠抗大鼠，1∶250，Santa Cruz公司)，β-actin抗体(小鼠抗大鼠，1∶500，Sigma公司)中4℃过夜，TBST清洗3次，每次10 min；放入稀释好的碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗兔、马抗小鼠IgG，1∶500，Santa Cruz公司)室温2 h。NBT-BCIP显色试剂盒显色。所得条带经扫描照片，以Image J 3.0软件进行光密度（D）值分析，以同一标本β-actin的产物D值作为内参，校正各自目的蛋白的积分D值，并按公式(相对D值=目标蛋白表达强度/该组2 h蛋白表达强度)计算出相对D值。
1.7 统计学处理 以SPSS 13.0进行数据分析，数据均以±ｓ表示，组内比较选用单因素方差分析，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 病理切片苏木精-伊红染色光镜观察 假手术组和缺血组缺血对侧脑组织皮质细胞层次分明， 神经细胞形态结构完整，间质无水肿。缺血组再灌注2 h即可见皮质神经元减少、胞体肿胀；至24 h神经元进一步减少，排列紊乱，胞质淡染，细胞周围间隙增宽，胞核溶解、结构不清；至72 h，细胞肿胀明显， 胞质呈空泡样，疏松化，大量神经元核固缩(图1A、B、C)。
2.2 免疫组化检测结果
2.2.1 神经元内c-fos表达 c-fos免疫反应阳性神经元核内呈棕黄色。假手术组大鼠各时间点在相应皮质区内c-fos阳性细胞少；缺血组再灌注2 h时c-fos阳性细胞数量增多，4 h增至最高峰，6 h阳性细胞多但较4 h有所下降，12、24、48、72 h进一步减少（表1）。表1 各组不同时间点c-fos阳性细胞数与假手术组比较:△P＜0.05;与前一时间点比较:#P＜0.05
2.2.2 星形胶质细胞GFAP表达 星形胶质细胞未受刺激时胞体小，突起细，数量少；在缺血后被激活，在细胞数量增加的同时，体积增大，突起多而粗大，GFAP阳性反应加深。假手术组大脑皮质可见少量GFAP阳性细胞散在分布。缺血组于再灌注4 h大脑皮质可见到较多GFAP阳性细胞，阳性细胞的胞体变大，突起多而粗大； 6、12、24 h阳性细胞数量明显增多，体积更大，至 48 h阳性细胞在数量及在体积上均达到高峰，72 h较48 h稍有下降(表2)。
2.2.3 GFAP阳性星形胶质细胞和c-fos阳性神经元的关系 在行GFAP和c-fos双重染色的切片上，可见GFAP阳性星形胶质细胞和c-fos阳性神经元均分布于缺血侧脑皮质，位置关系密切(图2)。表2 各组不同再灌注时间点GFAP阳性细胞数（免疫组化DAB、NBT-BCIP双重染色，×400） 转贴于 2.3 Western blot结果 假手术组内各时间点c-fos、GFAP表达无差异；缺血组c-fos于4 h表达最多，相对D值为同组2 h的（1.4±0.3）倍， GFAP为48 h组最多，为同组2 h的（2.1±0.5）倍。各组间c-fos表达灰度值比较见图3，GFAP表达相对D值比较见图4。
3 讨 论
各种病理生理损害均可刺激星形胶质细胞活化并合成GFAP，这个过程是星形胶质细胞对脑内严重损害的一种特有反应。脑缺血时星形胶质细胞内GFAP表达增多的机制目前认为可能有2种:①某些基因如c-fos表达增多［6］ ；②细胞内cGMP合成增加［7］。2种改变均可导致星形胶质细胞表达GFAP增加。GFAP增加意味着星形胶质细胞的活化，也增强了清除兴奋性神经递质和离子包括谷氨酸、H+、K+及自由基等的能力，且贮存糖原、合成细胞因子和神经营养因子增多，有利于重建神经元的完整性，修复神经功能［8］ 。
在脑外伤、缺血及癫疒间等中枢神经系统受损情况下，c-fos基因能很快作出反应，于受损区域神经细胞中表达增高。在细胞对外界刺激-转录耦联信息传递过程中，c-fos起着核内“第三信使”的重要作用：基因被激活后迅速转录形成mRNA，继而在胞质中合成蛋白，迅速转入核内，通过“亮氨酸拉链”与c-jun蛋白形成fos/jun异源二聚体，与靶基因激动蛋白-1(activator protein-1，AP-1)或CRE位点结合，激活靶基因表达，从而启动神经元的内源性抗损伤或损伤机制［9］ 。有研究认为c-fos 表达后具有双重效应［10］ ，既可介导细胞凋亡，又能参与细胞损伤后的修复，在神经细胞系统修复/防御系统完全被抑制时，c-fos 参与凋亡，未被抑制时参与神经细胞的损伤后修复。由于c-fos高表达均早于细胞凋亡的形态学和生化变化之前几小时或几天，故有人提出c-fos表达可能是脑缺血时细胞凋亡前兆。
本实验观察到在脑缺血/再灌注2 h后皮质区GFAP和c-fos的表达均有所增加，但c-fos的表达在再灌注后4 h时达到最高峰，明显早于GFAP的达峰时间（再灌注后48 h），与其他学者将两者单独研究得到的结果相类似［11-12］ 。同时免疫组化双重染色发现，GFAP阳性星形胶质细胞周围伴有c-fos阳性神经元的分布。因此，我们推测在缺血皮质区域，神经元的c-fos及星形胶质细胞GFAP的表达存在着一定的相关性。很有可能：缺血损伤发生时，c-fos表达的增高调控了星形胶质细胞的GFAP表达，随后GFAP反馈调节c-fos的表达，从而导致局部缺血损伤-抗损伤机制的激活，两者间存在一个“反馈环路”；也即说明在皮质区缺血发生时，神经元与神经胶质细胞间存在着较紧密频繁的“对话”。但其具体的相互作用的分子信息机制，仍需要进一步的深入研究。
【
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