【摘要】 目的 研究银杏叶提取物注射液金纳多（Ginaton）对大鼠肾缺血/再灌注（I/R）诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制。方法 SD大鼠分为假手术(Sham)组、再灌注(I/R)组、药物(Ginaton)组，每组6只。采用双侧夹闭大鼠肾蒂缺血45 min后再灌注3 h的方法制备肾缺血/再灌注模型。免疫组化法分析转录因子c-Jun的激活变化情况，TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡情况。结果 Sham组磷酸化c-Jun的活性变化不明显，I/R组磷酸化c-Jun的免疫活性显著增强，细胞凋亡数明显增加，与Sham组相比有统计学意义；金纳多明显抑制磷酸化c-Jun的免疫活性且减少了肾脏I/R诱导的细胞凋亡，与Sham组相比有统计学意义。结论 金纳多抑制肾I/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡、保护肾缺血性损伤的作用可能与抑制c-Jun的激活有关。
【关键词】 c-Jun 银杏叶提取物 缺血/再灌注 肾 细胞凋亡
Abstract:Objective To investigate the effects of Ginaton (a preparation of Ginkgo biloba extract) on the apoptosis induced by renal ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats.Methods The experiment was carried out in three rat groups: sham operation group (sham)， I/R group (I/R) and drug test group (Ginaton). The rat model of bilateral renal I/R injury was established by clamping the renal pedicles for 45 min and allowing 3 h of reperfusion. The p-c-Jun was examined by immunohistochemistry to investigate the effect of Ginaton on the activation of c-Jun. Apoptosis of renal tubular epithelial cells was assessed by TUNEL method.Results The p-c-Jun immunoreactivity and the number of apoptotic cells were significantly increased in the I/R group， compared with that in the sham group (P&<0.05). Administration of Ginaton 30 min before renal ischemia could significantly inhibite p-c-Jun immunoreactivity and decrease the number of apoptotic cells after 3 h of reperfusion (P&<0.05).Conclusion It is likely that Ginaton could potently decrease the I/R-induced renal tubular epithelial cell apoptosis by inhibiting the activation of c-Jun.
Key words: c-Jun; Ginkgo biloba extract; ischemia/reperfusion， kidney; cell apoptosis
肾脏缺血/再灌注（I/R）损伤是临床上导致急性肾功能衰竭(肾衰)常见原因，在肾脏相关手术如肾移植等，均可发生不同程度的再灌注损伤，目前仍无理想的防治措施。有研究证明， 肾脏缺血/再灌注损伤可能与细胞凋亡密切相关［1］。而最近的一些研究显示，I/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡与一些激酶和基因的激活、表达有关［2］。文献报道银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract， EGb）可以保护缺血性肾损伤［3］，但其机制仍然不清。本研究旨在探讨银杏叶提取物注射液金纳多（Ginaton）拮抗细胞凋亡的作用及其机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及试剂 健康雄性SD大鼠， 体重190～260 g， 由徐州医学院实验动物中心提供，生产许可证 SCXK（苏）2003-003，使用证 SYXK（苏）2002-0038。金纳多注射液(批号：050315)，每支5 ml，含有银杏叶提取物17.5 mg，其中银杏黄酮苷4.2 mg，德国威玛舒培大药厂出品。
1.2 缺血/再灌注模型制备 参照文献［3］方法适当加以改进。戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔麻醉，于脊柱旁双侧行肾区切口，暴露双侧肾脏。钝性分离肾包膜，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂造成肾缺血，肾脏由鲜红色立刻变为苍白表明缺血成功。缺血45 min松开动脉夹，恢复灌注，肾脏由暗红色逐渐变为鲜红，表明再灌注成功。
1.3 动物分组及处理 SD大鼠随机分成假手术(Sham)组、再灌注(I/R)组、药物(Ginaton)组，每组6只大鼠。Sham组除不夹闭肾蒂，其余同I/R组；I/R组行缺血/再灌注处理，无其他干预措施；Ginaton组术前30 min给予金纳多注射液（50 mg·kg-1， ip），其他同I/R组。再灌注3 h后，处死所有实验动物，取肾组织标本在液氮中速冻后转-80℃贮存待用，组织学标本按常规方法保存。
1.4 检测指标
1.4.1 组织学检测 肾组织标本用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，常规苏木精-伊红染色，观察各组肾脏病理改变。
1.4.2 免疫组化(Western blotting) 按文献［4］方法适当加以改进，肾组织石蜡切片，切片厚4 μm ，应用免疫组织化学方法检测肾组织中的磷酸化c-Jun的激活变化情况，操作按SP-9000 Hstostain Plus Kits免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行。结果判断: 磷酸化c-Jun阳性反应为细胞核深染呈棕褐色，不着色者为阴性。高倍镜下观察8个连续不重叠的视野，计数阳性细胞，统计分析结果。
1.4.3 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 肾组织标本常规处理， 4 μm厚切片， TUNEL染色按试剂盒（Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit， Chemicon公司）说明操作，DAB显色，苏木精复染。镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。高倍镜下观察，对8个连续不重叠的视野中阳性细胞进行计数。
1.5 统计学处理 数据以±s表示， Sigma Stat软件进行数据处理，采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组之间的比较采用q检验(Newman-Keuls法)， P&<0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 组织学观察 光镜下观察I/R组有肾小管损害现象：肾小管扩张、近曲小管刷状缘丢失、肾小管细胞核丢失。Paller′s法［5］评分:I/R组、Ginaton组的肾小管评分明显升高，与Sham组相比差异有统计学意义（P&<0.01）;Ginaton组肾小管评分较I/R组评分显著降低（P&<0.01）。见表1。
2.2 免疫组织化学 Sham组肾小管上皮细胞核中磷酸化c-Jun的免疫反应很弱，I/R组肾小管上皮细胞核中的磷酸化c-Jun的免疫反应明显增强，与Sham组相比，P&<0.01。金纳多明显减少I/R后的磷酸化c-Jun的免疫反应( P&<0.05)。见表2。表1 3组Paller′s评分 表2 3组磷酸化c-Jun活性检测与Sham组比较:**P&<0.01;与I/R组比较:#P&<0.05
2.3 细胞凋亡 高倍镜下观察，凋亡主要发生在肾小管尤其是远端小管。I/R组凋亡细胞明显增加，一部分脱落进入肾小管管腔，与Sham组相比，差异有统计学意义（P&<0.01）；Ginaton组阳性细胞数明显少于I/R组，差异有统计学意义（P&<0.05）。见表3。表3 3组凋亡细胞计数与Sham组比较:**P&<0.01;与I/R组比较:#P&<0.05
3 讨 论
I/R诱导细胞凋亡的机制很多。文献报道，肾脏I/R损伤与氧自由基(也叫活性氧族， ROS)的过量生成有密切关系［6］。缺血/再灌注时产生大量氧自由基，过量的氧自由基除了通过脂质、蛋白质、核酸的过氧化作用直接诱发细胞凋亡加重缺血/再灌注损伤外，还通过促进转录因子c-Jun的激活，调节基因的转录，从而诱导细胞的凋亡。c-Jun是AP-1家族的重要成员，它的持续过度表达可诱导细胞凋亡。研究发现，缺血/再灌注后c-Jun可迅速被激活，c-Jun的过度激活与表达能提高转录因子复合物AP-1的DNA结合活性，促进多种凋亡蛋白的表达，从而启动下游级联反应导致细胞凋亡［7-8］。
本研究结果显示，金纳多能明显抑制转录因子c-Jun的激活。而且，预防性给予金纳多，缺血/再灌注后凋亡细胞明显减少，组织损害明显减轻。提示金纳多对抗氧化应激引起的细胞凋亡，保护肾缺血性损伤，可能是通过抑制转录因子c-Jun的表达，进一步下调靶基因的表达来实现的。
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