作者：李伟，张红，殷松楼，褚璇
【关键词】 链脲佐菌素
摘要 :目的 探讨不同剂量链脲佐菌素（STZ）致SD大鼠糖尿病肾病模型状况的差异。 方法 58只雄性SD大鼠随机分为5组，模型组大鼠（4组，每组12只）腹腔一次性注射40、50、60、70mg.kg的STZ以建立糖尿病模型;非糖尿病对照组10只，仅予注射缓冲液。注射后24、72h检测血糖，8周观察糖尿病大鼠尿微量白蛋白、血尿素氮、肾脏指数及肾组织光镜和超微结构等变化。 结果 腹腔注射STZ60mg.kg成模率高，模型死亡率较低。8周后大鼠尿微量白蛋白水平即升高，肾脏超微结构检查系膜细胞增生、基质增多、肾小球基底膜增厚。 结论 腹腔注射STZ60mg.kg是致糖尿病SD大鼠发生肾病的最佳剂量。
关键词 :链脲佐菌素;糖尿病肾病;动物模型;剂量
Abstract:Objective To investigate the differences in diabetic nephropathy model rats induced by streptozotocin（STZ）of varied dosage.Methods 58male SD rats were randomly pided into4diabetic groups（n=12each）and1control group（n=10）to receive varied doses of intraperitoneal STZ and buffer solution respectively.The blood sugar and general conditions were monitored1-3days after the injection.Eight weeks later，the urinary microalbumin，blood urea nitrogen，kidney index and the ultrastructure of kidneywere examined.Results The success rate of model makingwas relatively high and the mortality was relatively low in the STZ60mg.kg group.After8weeks，the urinary microalbumin was found significantly higger than nor-mal.Ultrastructural study of the kidney showed proliferation of mesangial cells，increase of mesangial matrix and thickening of glomerular basement membrane.Conclusion STZ60mg.kg ip is the dose of choice for inducing nephropathy in rat models of diabetes.
Key words:streptozotocin;diabetic nephropathy;animal model;dosage
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的并发症，是糖尿病患者的主要死因之一。在1型和2型糖尿病的患者中，约30%发展为糖尿病肾病，且一旦出现，多数患者将进展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）。目前，随着糖尿病发病率的不断增加，导致了ESRD的大量增长［1］ ，但是其发病机制及防治措施并未完全清楚。因此，建立较理想的动物模型来研究该病的相关问题将具有重要意义。建立糖尿病动物模型的方法较多［2］ ，包括:①胰腺切除法;②化学药物特异性破坏胰岛β细胞，如链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、四氧嘧啶、生物制剂等;③胰腺部分切除联合化学药物制作糖尿病模型;④病毒诱导法，如柯萨奇病毒等;⑤自发性动物模型，如KK小鼠、NOD小鼠、ob.ob小鼠、db.db小鼠、NSY小鼠、BB糖尿病大鼠、Zucker fa.fa大鼠等;⑥转基因糖尿病模型。其中以注射STZ建立动物模型的方法应用最多，但关于注射的剂量众说不一。本试验通过研究不同给药剂量致DN模型差异，为制造DN模型选择一种最佳方案。
1 材料和方法
1.1 实验动物和材料 清洁级雄性Sprague-Daw-ley大鼠60只（徐州医学院实验动物中心提供），体重200～250g，喂养于屏障系统内，饲以标准颗粒饲料，单笼喂养，12h交替光线照明，室内通风良好，室温20～27℃，相对湿度40%～70%，氨浓度&<14mg.m 3 。STZ购自美国Sigma公司。
1.2 动物分组 58只大鼠随机分为5组:A、B、C、D组腹腔分别注射STZ40、50、60、70mg.kg，每组12只;E组腹腔注射柠檬酸缓冲液2ml，即正常对照组10只。
1.3 糖尿病大鼠模型的制备 所有大鼠注射STZ前禁食24h，将STZ以浓度为0.1mol.L、pH4.4的柠檬酸盐缓冲液于临用前配制成1%STZ溶液，模型组大鼠腹腔注射STZ后24h即检测血糖（BG），72h复查，BG持续高于16.7mmol.L并出现多饮、多尿、多食、体重减轻为模型成功。成模后每2周检测1次血糖，并观察大鼠一般状况。
1.4 标本采集及测定方法 8周时所有大鼠用代谢笼收集24h尿，保存于-20℃冰箱中，用于尿微量白蛋白（UMA）测定;10%水合氯醛0.35ml.kg腹腔麻醉，右心室采血分离血清，测定尿素氮（BUN）、糖化血红蛋白（HbA1c）。取双肾，去包膜称左肾重量，右肾部分置于10%中性甲醛中固定，留作苏木精-伊红染色，另将肾皮质细切为1mm×1mm×1mm大小，用2%戊二醛固定，留待做透射电镜检查。
BG由德国罗氏血糖仪检测，UMA用胶体金双抗体夹心法检测，HbA1c用亲和层析法检测，BUN由日立7600型全自动生化分析仪测定。肾脏肥大指数以肾重.体重（g.kg）表示。
1.5 肾脏组织病理学检测 苏木精-伊红染色观察肾组织病理形态学变化。透射电镜观察肾小球基 底膜厚度改变:4%戊二醛前固定2h以上的组织充分漂洗后，置于1%四氧化锇后固定2h，漂洗后梯度乙醇脱水、浸透，618环氧树脂包埋，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，最后置于透射电镜下观察。
1.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行数据处理，计量数据以ˉx±s表示，组间差异性比较采用单因素方差分析，双侧检验，以P&<0.05判定差异有显著意义。
2 结果
2.1 成模状况 空腹注射不同剂量STZ的4组大鼠糖尿病成模率无显著性差异，但各组大鼠之间的死亡率差别明显，除B组和C组无差异外，其余各组均有显著性差异，其中D组死亡率最为明显，高达66.67%。见表1。
表1 各组大鼠成模及8周时死亡率情况（略）
与D组比较:*P&<0.05;与A组比较:△P&<0.05
2.2 一般状况观察 成模后糖尿病大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、体重减轻、毛发枯黄无光泽，垫料极潮，每天需更换1～2次。注射STZ后1天～1周是死亡率较高的一个时期，其中前3天死亡率最高，死亡原因考虑为酮症酸中毒和（或）STZ毒性作用。
2.3 各组BG、BUN、肾脏肥大指数、尿微量白蛋白比较 见表2。
5组大鼠HbA1c两两比较结果显示，各糖尿病大鼠组间的HbA1c无显著性差异，而与正常对照组比较有显著性差异（P&<0.05）。
5组大鼠BUN两两比较结果显示，除A组和B组间及C组和D组间无显著性差异外，其余两两比较BUN均有显著性差异（P&<0.05）。说明各糖尿病组大鼠肾功能有不同程度的损害，以C、D两组大鼠肾脏损害更为明显。
各组大鼠肾脏肥大指数指数两两比较后同BUN结果相似，意义相似。
除A组与E比较无差异外，其余各组糖尿病大鼠尿微量白蛋白均有显著差异;同时发现，B组和C组大鼠及C组和D组大鼠间无显著性差异，而B组和D组间尿微量白蛋白有显著性差异。
表2 8周时各组血糖、血尿素氮、肥大指数、尿微量白蛋白比较（略）
与C组比较:*P&<0.05;与D组比较:△P&<0.05;与E组比较:#P&<0.05
2.4 肾脏组织形态学观察 见图1。光镜显示，与正常对照组相比，C组和D组表现出明显的肾小球细胞增多，肾小球毛细血管狭窄，部分闭塞，肾小管空泡变性，肾小管周围明显的炎症细胞浸润;A组较正常对照组无明显改变;B组肾小球细胞轻度增多部分肾小球毛细血管腔狭窄。
图1 肾小球形态学变化（苏木精-伊红染色，×400）（略）
（a）正常对照组;（b）A组，较正常对照组无明显改变;（c）B组，可见肾小球细胞轻度增多，部分肾小球毛细血管腔狭窄;（d）C组，可见明显的肾小球细胞增多，毛细血管狭窄，部分闭塞;较a、b、c图改变均较明显;（e）C组肾小管，可见肾小管空泡变性，肾小管周围明显炎症细胞浸润;（f）D组，明显的肾小球细胞增多，毛细血管腔狭窄，部分闭塞;较d图无明显改变。
图2 大鼠肾小球超微结构（略）
（a）正常对照组（×6000）;（b）A组（×6000），较正常对照E组无明显改变;（c）B组（×6000），可见肾小球基底膜增厚;（d）C组（×6000），可见明显的肾小球基底膜增厚;（e）C组（×3000），明显的肾小球系膜细胞增生;（f）D组（×6000），明显的肾小球基底膜增厚，较C组无明显差别。
3 讨论
STZ为一种广谱抗生素，具有抗肿瘤性能和致糖尿病的副作用，对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性破坏作用。国内外研究［3～4］ 已公认其直接特异性杀伤胰岛β细胞是STZ诱发糖尿病的机制。许多研究［5］ 对于STZ诱导的糖尿病一次性注射的剂量报道不一，且报道模型成功率较高，但不同注射剂量的STZ是否均可较早引起肾脏的明显损害报道相对较少。因此，寻找一种较佳注射剂量以在较短时间内复制出明显的肾脏病理学损害的模型，对于需亟待解决的DN研究显得尤为重要。
研究［6］ 表明，到目前为止，大部分对DN肾组织病理变化的研究通常使用STZ诱导的动物模型。许多病理学特征如蛋白激酶C的激活、糖基化终末产物的沉积、系膜细胞的活化增生、肾小球囊细胞损伤等的描述均使用此模型作为研究对象。George等［7］ 对早期STZ糖尿病肾组织血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）的研究表明，65mg.kgSTZ腹腔注射2周后即可观察到典型的血糖升高、体重减轻及明显的肾脏肥大的早期病理学改变。Gross的研究［6］比较了STZ诱导的糖尿病大鼠和SHR.N-cp糖尿病大鼠模型的肾脏病理学改变，虽然SHR.N-cp大鼠肾脏损害在某些方面较STZ诱导的大鼠更明显，但后者仍表现出了明显类似与糖尿病患者的肾脏损害，如明显增高的尿蛋白排泄率、肾小球体积明显持续增高、肾小球平均的球囊细胞数量明显减少而体积明显增大、系膜细胞和内皮细胞数量及体积均明显增高、肾小球毛细血管闭塞和明显增厚的肾小球基底膜。国内对于糖尿病肾脏并发症的研究［8～9］ 大多选用STZ腹腔注射模型，但是注射剂量众说不一。
本实验按4种不同注射剂量的STZ一次性腹腔注射给SD大鼠制膜。本实验选择腹腔注射考虑到大鼠尾静脉细而深，而腹腔注射操作方便。试验中所有STZ腹腔注射后大鼠糖尿病模型均成功，较报道的成功率60%～65%［10］ 为高，考虑可能与STZ纯度、是否现配现用、是否低温下操作及环境条件、地域差别、注射技巧等有关。各组指标统计结果提示:C组（60mg.kg）与D组（70mg.kg）肾损指标无统计学意义，但与B组（50mg.kg）有显著性差异;而且C组死亡率（41.67%）较D组（66.67%）显著性降低，与B组无差异，说明C组DN模型较好。因此，通过本实验结果以及王禹斌等［11］ 资料，我们认为，腹腔注射STZ60mg.kg是制造糖尿病大鼠肾脏并发症模型的最佳剂量。
参考文献 :
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