作者：魏志平，刘彦群，张昕博
【关键词】 皮肤鳞状细胞癌
摘要 :目的 探讨P16、Cyclin D1和pRb蛋白在皮肤鳞状细胞癌（简称皮肤鳞癌）中的表达及他们的相互关系和意义;研究p16基因甲基化是否与原发性皮肤鳞癌的发生有关。 方法 采用PCR为基础的限制性内切酶甲基化法及免疫组化S-P法检测40例原发性皮肤鳞癌组织中p16基因甲基化状态及P16、Cyclin D1和pRb蛋白的表达，并以10例正常皮肤组织作对照。 结果 皮肤鳞癌组织P16蛋白、Cyclin D1阳性表达率分别为37.5%和57.5%;P16蛋白表达与Cyclin D1的表达呈显著负相关（r=-0.3162，P=0.008）。皮肤鳞癌中P16蛋白和pRb表达呈显著负相关（r=-0.4007，P&<0.05）。p16基因的甲基化阳性率为42.5%。2级皮肤鳞癌组织中P16蛋白及p16基因甲基化阳性表达率比1级鳞癌组织显著增高（P&<0.05），而Cyclin D1和pRb阳性率表达则显著降低（P&<0.05）。在有淋巴结转移组中P16蛋白及p16基因甲基化阳性率与无淋巴结转移组相比显著降低（P&<0.05），而Cyclin D1和pRb阳性率则显著增加（P&<0.05）。 结论 在原发性皮肤鳞状细胞癌中存在P16蛋白低表达、Cyclin D1高表达的异常表达现象，两者的表达相互抑制，呈显著负相关;P16蛋白和pRb蛋白的表达呈负相关;p16基因甲基化与皮肤鳞癌病理分级、淋巴结转移之间有显著关系。提示p16基因甲基化在皮肤鳞癌的发生发展过程中起重要作用。
关键词 :皮肤鳞状细胞癌;p16基因甲基化;Cyclin D1;pRb
Abstract:Objective To investigate the expression and its significance of P16，Cyclin D1and pRb in human cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）and the relationship between the three proteins，and to investigate the relationship between the methylation of p16gene and the development of the CSCC.Methods PCR-based methylation assay and S-P immunohisto-chemistry methods were applied to determine the methylation of p16gene and the expression of P16，Cyclin D1and pRb in40cases of primary CSCC and10normal skin tissue control samples.Results The expression rates of Cyclin D1and pRb protein were57.5%and52.5%respectively in the40cases of primary CSCC.Inverse correlation was found between P16and Cyclin D1，and between P16and pRb as well（P&<0.05）.The methylation rate of p16gene was42.5%.The positive expression rates of P16and p16gene methylation were significantly decreased in CSCC grade2，as compared with that in CSCC grade1（P&<0.05）.Conversely，the former were lower，while the latter were higher，in the CSCC with lymphatic metastasis than in the CSCC without（P&<0.05）.Conclusion The low expression of P16protein and the methylation of p16gene are significantly involved in the development of CSCC.
Key words:cutaneous squamous cell carcinoma;methylation of p16gene;Cyclin D1;pRb
近年来，细胞周期相关性抑癌基因的改变在皮肤鳞状细胞癌（皮肤鳞癌）的发生发展中所起的作用倍受重视，其中p16基因更成为这一领域的研究热点。本研究通过免疫组化S-P法、甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法从蛋白质、DNA水平检测抑癌基因p16在皮肤鳞癌组织中的表达与甲基化情况，为寻找皮肤鳞癌相关的分子生物学指标并阐明其发病机制提供依据，对皮肤鳞癌的诊断、治疗、预后有着重要的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 40例原发性皮肤鳞状细胞癌组织取自徐州医学院附属医院病理科1992年至2002年手术切除标本，男性22例、女性18例，年龄30～87岁，平均56.5岁。所有标本经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。所有病例均为确诊病例。按Brod-ers分级，Ⅰ级17例，Ⅱ级23例。10例正常皮肤组织取自包皮环切术切除组织。
1.1.2 试剂 P16蛋白、Cyclin D1及pRb单克隆抗体（即用型）、S-P试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术开发公司。限制性内切酶HpaⅡ、CfoⅠ，Wizard Geneomic DNA Purification Kit、PCR Master Mix均购自美国Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 常规S-P免疫组化染色法 实验步骤按产品说明书进行。用所购阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。染色结果判定标准:以细胞核出现棕黄色颗粒定为阳性。根据文献和Gen-Bank中人p16基因外显子序列，设计2对引物扩增外显子1和β-肌动蛋白内参照。外显子1:上游5′GAA GAA AGA GGA GGG GCT G3′，下游5′GCG CTA CCT GATTCC AATTC3′。β-肌动蛋白:上游5′GAA TTC ATG TTT GAG ACC TTG AA3′，下游5′GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A3′。引物由上海Gib-co公司合成，DNA标准参照物由上海生工生物有限公司合成。
1.2.2 聚合酶链反应（PCR）
1.2.2.1 基因组DNA的提取 采用经典的酚-氯仿提取法提取基因组DNA，所得模板稀释后，测吸光度值A 260 和A 280 ，计算DNA含量及纯度，TE缓冲液溶解至0.25g.L。
1.2.2.2 酶切 40例皮肤鳞癌组织及10例对照皮肤组织DNA各取4μl，分别加HpaⅡ1μl、CfoⅠ1μl、10×buffer1μl、双蒸馏水4μl，总体积10μl，离心后置于37℃恒温箱内消化16h，然后置于65℃恒温箱内15min终止消化。
1.2.2.3 PCR扩增 反应体系为:模板DNA5μl（酶切产物），10mmol.L dNTP0.5μl，50pmol.L上下游引物各1μl，10×buffer5μl，Taq酶3U，加双蒸馏水至50μl，混匀，加石蜡油覆盖，离心，放入PCR仪扩增。循环参数:92℃变性1min，55℃60s，72℃60s，30个循环后72℃延伸5min。
1.2.2.4 电泳 取10μl PCR产物，EB染色，在2%琼脂糖凝胶上电泳分析，并以平行扩增的β-肌动蛋白为内参照，紫外灯下观察结果。
1.2.3 DNA甲基化判断标准 有甲基化:经2种酶消化，PCR扩增、电泳后，可见340bp特异性条带;无甲基化者则340bp处无特异性条带。
1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件对数据进行χ 2 检验和相关分析，P&<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 P16蛋白、Cyclin D1及pRb在皮肤鳞癌组织中的表达及其相互关系 40例皮肤鳞癌组织中，15例（37.5%）P16蛋白表达阳性，25例（62.5%）阴性。在Cyclin D1表达中，23例（57.5%）阳性，17例阴性（42.5%）。pRb表达中，21例阳性，19例阴性，阳性表达率为52.5%。11例（27.5%）为P16蛋白和Cy-clin D1同时表达或缺失。10例正常皮肤组织标本中P16蛋白表达均为弱阳性，Cyclin D1及pRb表达 均为阴性。
在P16蛋白阳性的15例皮肤鳞癌组织中:Cyc-lin D1阳性者5例，阴性者10例;pRb阳性者4例，阴性者11例。在P16蛋白阴性的25例皮肤鳞癌组织中:Cyclin D1阳性者19例，阴性者6例;pRb阳性者17例，阴性者8例。统计分析结果显示:P16蛋白与Cyclin D1两者之间r=-0.3162，χ 2 =7.1111，P=0.008，两者呈显著负相关。P16蛋白与pRb两者之间r=-0.4007，χ 2 =6.4228，P=0.011，两者呈显著负相关。
2.2 P16蛋白、Cyclin D1和pRb与皮肤鳞癌临床指标的关系 结果见表1。结果表明，随着皮肤鳞癌病理分级的提高，P16蛋白的阳性表达率显著降低（P&<0.05），而Cyclin D1和pRb阳性表达率显著增高（P&<0.05）。在有淋巴结转移的皮肤鳞癌组织中，P16蛋白的阳性表达率与无淋巴结转移组相比显著增加（P&<0.05），而Cyclin D1和pRb的阳性表达率则显著降低（P&<0.05）。
表1 P16蛋白、Cyclin D1及pRb与皮肤鳞癌临床指标的关系（略）
2.3 p16基因甲基化在皮肤鳞癌组织及正常组织中的表达 42.5%（17.40）的皮肤鳞癌组织中发生p16基因甲基化现象，其中HpaⅡ型8例，CfoⅠ型11例，两者同时出现甲基化者2例（图1）;17例甲基化者有4例（23.5%）发生在1级鳞癌组织，13例（56.5%）发生在2级鳞癌组织;有淋巴结转移组和无淋巴结转移组患者中分别有10例（66.7%）、7例（28.0%）发生p16基因甲基化现象;而全部10例正常皮肤组织中均未见甲基化现象。χ 2 分析结果表明，1级与2级皮肤鳞癌之间甲基化的表达差异有统计学意义（P=0.037），有淋巴结转移和无淋巴结转移的皮肤鳞癌组织之间p16甲基化的表达差异有统计学意义（P=0.017）。
图1 限制性内切酶-PCR法的甲基化分析结果（略）
M为DNA标准参照物;122bp为β-肌动蛋白;1为正常皮肤组织;3、5为非甲基化条带;2、4分别为限制性内切酶HpaⅡ、CfoⅠ酶切阳性
3.1 P16蛋白、Cyclin D1和pRb的表达与皮肤鳞癌的关系 p16基因对细胞周期调控是通过P16.Cyc-lin D1.pRb途径得以实现的:Cyclin D1被认为是一个癌基因，作用是与CDK4结合并使之激活，从而催化pRb磷酸化，使细胞从G 1 期进入S期，从而进入自主分裂程序。而P16蛋白可特异性地直接与CDK4亚单位结合，竞争性抑制了Cyclin D1与之结合，CDK4不能被激活，pRb不被CDK4磷酸化，细胞被阻制于G 1 .S期，停止增殖。可见P16是CDK4特异性的抑制子（inhibitor），故p16又被称为p16INK4［1］ 。本研究用免疫组化方法检测了40例皮肤鳞癌组织和10例正常皮肤组织中P16、Cyclin D1和pRb蛋白的表达状态及相互关系。在40例肿瘤标本中检出25例P16蛋白表达缺失，缺失率为62.5%，而全部正常皮肤组织P16蛋白均为弱阳性。P16蛋白表达缺失在低分化皮肤鳞癌中比高分化皮肤鳞癌中更易见到，表明P16蛋白表达的缺失在皮肤鳞癌的发展中可能起重要作用。本研究结果显示，皮肤鳞癌组织中P16阳性表达率明显低于正常组织，2组之间有显著性差异（P&<0.05），这和国外的研究结果相一致［2］ 。
本研究结果还显示，随着皮肤鳞癌组织恶性程度的增高，P16表达的阳性率明显下降，且差异有显著性（P&<0.05）;Cyclin D1表达的阳性率明显上升，且差异有显著性（P&<0.05）;Rb蛋白的阳性表达率明显增高，在临床各级之间的表达差异有显著性（P&<0.05）。说明P16蛋白、Cyclin D1、Rb蛋白的表达均与肿瘤分化程度密切相关。有淋巴结转移和无淋巴结转移的皮肤鳞癌组织中P16蛋白的表达有显著性差异，提示P16表达与皮肤鳞癌的转移有关，这对皮肤鳞癌患者发病机制研究及判断患者预后具有普遍意义。
3.2 皮肤鳞癌中P16蛋白与Cyclin D1、pRb表达的相关性 本实验结果显示:从P16蛋白与Cyclin D1的相关性分析看，P16与Cyclin D1的表达呈负相关。P16阴性而Cyclin D1阳性表达者，具有更强的侵袭性、转移能力，预后较差;P16阳性而Cyclin D1阴性表达者则有相反结果。有27.5%的肿瘤组织存在P16和Cyclin D1同时表达或缺失，说明皮肤鳞癌的生物学行为取决于两者的综合作用。
从P16蛋白和pRb表达的相关性分析看，两者的表达呈负相关，在70%的肿瘤组织中两者的表达模式为P16阳性.pRb阴性或P16阴性.pRb阳性。实验研究表明，pRb基因的转录可导致P16表达缺失。已有文献报道，在口腔鳞癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胃癌中均发现两者存在负相关现象［3-4］ 。这些研究表明，P16和pRb在G 1 .S期调控点构成一个反馈调节环;P16和pRb两者中任何一个异常都可使G 1 期细胞增殖失调，从而调节细胞周期进程。
综上所述，本研究表明在皮肤鳞癌的发生发展 过程中存在P16的表达缺失现象，且P16.Cyclin D1.pRb通路异常在皮肤鳞癌发生中占有重要地位;此通路中P16和pRb、P16和Cyclin D1呈负相关性，pRb和Cyclin D1之间无显著相关性。
3.3 p16基因甲基化与皮肤鳞癌的相关性 40例皮肤鳞癌组织中17例发生甲基化现象，其中HpaⅡ型8例，CfoⅠ型11例，两者同时出现甲基化有2例，而10例正常皮肤组织中均无甲基化出现，2组比较有显著性差异（P&<0.05）。这表明，甲基化是p16基因失活的一种重要方式，在皮肤鳞癌的发生与发展中可能起重要作用。p16基因甲基化与皮肤鳞癌分级相关，2级皮肤鳞癌组织中p16基因甲基化率明显高于1级者，提示在各种致癌因素作用下，一旦p16基因获得甲基化失活，则可促进肿瘤的恶性进展。有淋巴结转移和无淋巴结转移的皮肤鳞癌之间p16甲基化表达有显著性差异，提示p16基因甲基化与皮肤鳞癌转移有关。
p16基因甲基化而致基因失活的另一个重要意义是p16甲基化所致的表达异常是可逆性的。5′CpG岛甲基化对去甲基化剂5-氮-2-脱氧胞苷（5-AZA-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）非常敏感，而正常体细胞受5′CpG岛甲基化调节的基因较少，使用去甲基化剂不可能引起正常组织中有功能的基因表达异常。
综上所述，在皮肤鳞癌的发生发展过程中，伴有p16基因的甲基化现象，从而导致p16基因表达阴性。由于细胞失去了负性调控作用，从而增殖过度易于发生恶性转化和肿瘤转移，因而导入正常p16基因可能对突变细胞向表型的良性转化有一定价值。目前已有用腺病毒介导的p16基因转导治疗喉癌的报道，可使肿瘤细胞发生凋亡、细胞周期阻滞，肿瘤细胞生长停滞［5］ ，这将为皮肤鳞癌临床开展基因治疗提供依据。
参考文献 :
［1］ Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D.CDK4［J］.Nature，1993，366（6456）:704-707.
［2］ Ai L，Stephenson KK，Ling WH，et al.The p16（CDKN2a）tumor-suppressor gene in head and neck squamous cell carcinoma:a promoter methylation and protein expression study in100cases［J］.Mod Pathol，2003，16（9）:944-950.
［3］ El-Naggar AK，Lai S，Clayman GL，et al.Expression of p16，Rb，and cyclin D1gene products in oral and laryngeal squamous carcinoma:bio-logical and clinical implications［J］.Hum Pathol，1999，30（9）:1013-1018.
［4］ Benedict WF，Lemer SP，Zhou J，et al.Level of retinoblastoma protein expression correlates with P16（MTS-1.INK4A.CDKN2）status in bladder cancer［J］.Oncogene，1999，18（5）:1197-1203.
［5］ Lee AW，Li JH，Shi W.p16gene therapy:a potentially efficacious mo-dality for nasopharyngeal carcinoma［J］.Mol Cancer Ther，2003，2（10）:961-969.转贴于