【关键词】 脑缺血 亚低温 PI3K Akt途径
近年来的研究表明，亚低温对缺血/再灌注后脑组织损伤具有明显的保护作用［1］。虽然亚低温可以通过降低脑代谢率而起保护作用，但这并不能完全解释其保护机制。一般认为，脑缺血可引起脑神经细胞凋亡及其相关基因的表达，亚低温通过影响凋亡/抗凋亡生化途径中的相关因子，对脑缺血/再灌注损伤起保护作用。目前对亚低温的神经保护作用的确切机制还不清楚。本实验使用全脑缺血/再灌注大鼠模型研究亚低温的神经保护作用，并通过抑制抗凋亡的PI3K/Akt途径探讨亚低温神经保护作用的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为5组，每组4只：假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(ischemia/reperfusion， I/R)、低温缺血/再灌注组(hypothermic ischemia/reperfusion， HI/R)、低温缺血/再灌注给药组(HI/R+LY294002)、低温缺血/再灌注溶剂对照组(HI/R+DMSO)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 按本实验室已建立的大鼠四动脉结扎模型，动物以20％水合氯醛(300～350 mg／kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。手术第2天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，然后再灌注5天。缺血时保持大鼠（非低温组）直肠温度37℃，以体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组不结扎双侧颈总动脉。低温组从缺血前10 min开始通过体表全身喷洒乙醇物理降温，开始再灌注后持续3 h保持大鼠直肠温度32℃。
1.2.2 给药 LY294002溶于DMSO中，浓度为 25 mmol/L，给药体积5 μl，缺血前20 min脑室注射给药；溶剂对照组给予等体积DMSO。
1.2.3 样品制备和组织学检查 再灌注5天后，以水合氯醛麻醉大鼠。接着以生理盐水和4％多聚甲醛进行心室灌注。然后取脑块放于4℃下4%多聚甲醛中固定1天。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。取海马齿状回互包段连续冠状切片，片厚5 μm，切片经脱蜡、晾干，0.1％焦油紫(cresyl violet)染色10～20 min，梯度乙醇分色，光镜下观察神经元紫色而背景基本无色为止，脱水，透明，封片。显微镜下计数CA1区1 mm宽度内的存活锥体细胞。
1.3 统计学处理 数据以±s表示，应用Sigma Stat统计软件，采用单因素方差分析(ANOVA)，P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
光镜下可见：Sham组、HI/R组和HI/R+DMSO组海马CA1区细胞分布均匀整齐；I/R组和HI/R+LY294002组出现大量死亡细胞，存活细胞较少，表现为细胞破碎、核固缩、溶解（图1）。各组大鼠脑缺血复灌后海马CA1区细胞存活量统计结果见表1。与I/R组相比，HI/R组存活细胞明显增加（P&<0.05）；与HI/R组和HI/R+DMSO组相比，HI/R+LY294002组存活细胞明显减少（P&<0.05）。表1 各组大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区细胞存活数
3 讨 论
在脑缺血/再灌注过程中，细胞凋亡是多种途径共同参与的结果，线粒体途径通过从线粒体释放细胞色素c，激活caspase-3导致细胞凋亡；细胞核途径则通过激活MAPK家族成员，如JNK等，进一步通过调控核内转录因子活性和相关基因的表达，促进细胞凋亡［2］。近年来，抗凋亡（促增殖）途径，如PI3K/Akt途径，在缺血性脑损伤保护中的作用受到越来越多的重视。
PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)活化而产生的类脂产物3，4—二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和3，4，5—三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)作为第二信使可激活细胞内多种靶蛋白，最终调节细胞的增殖、分化、存活等过程［3］。Akt，即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(PKB)，是PI3K直接的下游作用靶点。Akt通过磷酸化一系列凋亡调控蛋白，如BAD、caspase-9、NF-κB等，进一步调节抗凋亡基因的转录，促进细胞存活［4］。对PI3K/Akt途径的调控可以降低脑缺血/再灌注引起的脑损伤［5］。 亚低温可以通过抑制凋亡途径对大鼠脑缺血/再灌注损伤发挥保护作用，如亚低温不仅降低caspase-3依赖性通路中的关键酶caspase-3的表达，而且降低caspase-3非依赖性通路中的关键蛋白AIF的表达［6］。对于抗凋亡的PI3K/Akt途径，在大鼠局灶脑缺血模型中发现，亚低温组比常温组Akt表达水平显著增高，抑制NF-κB的核内移，从而抑制神经元凋亡［7］。同时，亚低温还通过增加bcl-2的表达、降低Bax的表达和细胞色素c的释放，发挥其保护作用［8］。但是，在全脑缺血模型中，对亚低温保护机制的研究目前还相对较少。
在本实验中，我们通过考察缺血/再灌注早期3 h亚低温的神经保护作用，发现缺血/再灌注早期3 h亚低温很好地减少了再灌注5天后海马CA1区锥体细胞的死亡；同时，缺血前20 min脑室注射PI3K的抑制剂LY294002降低了3 h亚低温的神经保护作用。这说明，亚低温对全脑缺血/再灌注的神经保护作用是和抗凋亡（促增殖）的PI3K/Akt途径相关的。本实验也为临床治疗缺血性脑损伤提供了一定的理论依据。
参考文献
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