作者：王炎强，刘洪梅，王红军，曹俊平，肖成华，高殿帅
【关键词】 多巴胺能神经元
摘要 :目的 研究经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GD-NF）对帕金森病（Parkinson disease，PD）模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用。 方法 利用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）制备成年小鼠PD模型，通过单侧纹状体定位注射GDNF，取中脑黑质节段，做连续冠状石蜡切片，结合免疫组织化学染色方法，观察各组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、钙结合蛋白（calbindin D28k，CB）的表达，光镜观察并细胞计数，统计学分析。 结果 在模型制备的第4、6天，单侧纹状体定位注射GDNF后，小鼠黑质致密部TH与CB阳性神经元数量显著多于注射PBS组。 结论 经纹状体注射GDNF对成年PD小鼠黑质多巴胺能神经元具有保护作用，且这种保护作用可能与细胞内CB表达增加有关。
关键词 :胶质细胞系源性神经营养因子;多巴胺能神经元;1-甲基4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶
Abstract:Objective To investigate the protective effect of intrastriatal GDNF on dopaminergic（DA）neurons in the sub-stantia nigra of MPTP-induced mouse model of Parkinson disease（PD）.Methods The PD model was established in adult KM mice four or six days after an intraperitoneal injection of MPTP30mg.kg.The model mice were then treated by giving GD-NF into the striatum.After a seven-day survival period，the model mice were sacrificed to get the segment of substantial nigra（SN）fixed，embedded and coronally sectioned continuously.The microsections were processed by immunohistochemistry using anti-TH and anti-CB antibodies to label DA neurons and CB-containing neurons respectively，which were counted under microscope and analyzed statistically.Results Seven days after the steriotaxic intrastriatal injection of GDNF，the numbers of TH and CB positive neurons were found significantly higher than that in the untreated model mouse control group.Conclusion Intrastriatal GDNF can protect DA neurons in PD model mice，and this role may be related to the increase of CB expression.
Key words:glial cell line-derived neurotrophic factor;dopaminergic neurons;1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tet-rahydropyridine
帕金森病（PD）是一种中枢神经系统退行性疾病，主要病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性死亡，导致其靶区尾状核与壳核内的多巴胺含量降低［1-2］ 。胶质细胞系源性神经营养因子（GD-NF）是多巴胺（DA）能神经元的神经营养因子之一，自从1993年由Lin等人从大鼠B49胶质细胞系中分离纯化后，大量的实验证实其对腹侧中脑DA能神经元有特异性的促存活和促形态学分化作用［3～7］ 。由于GDNF是神经肽类大分子物质，不能通过血脑屏障，所以在应用GDNF治疗PD的过程中，主要问题在于如何让其越过血脑屏障而进入中枢神经系统。我们实验室已证明了向PD模型大鼠的黑质部位注射GDNF，能明显改善PD症状，促进DA能神经元的存活。但是黑质位置较深、范围局限，直接向黑质注射GDNF，损伤相对较大、难度相对较高。于是设想如果向DA能神经元的靶区纹状体注射GDNF，是否会通过逆行运输而保护黑质致密部的DA神经元呢?我们通过利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）构建的PD模型小鼠，经纹状体注射外源性GDNF，观察黑质致密部TH和CB阳性神经元的数量变化情况，评价经此途径给予GDNF对黑质DA能神经元的保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂和主要仪器 胶质细胞系源性神经营养因子（glial cellline-derived neurotrophic factor，GD-NF），MPTP，小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（一抗），Sigma公司;生物素结合的羊抗小鼠单克隆抗体（二抗），Sigma公司;封闭用羊血清原液，北京中杉生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的生物素卵白素复合物，Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯或化学纯。YL3A型回转式石蜡切片机，上海仪表厂;病理组织漂烘处理仪，江苏常州中德电子仪器厂;Olympus光学显微镜，日本;Olympus PM-CB20显微照相系统，日本;LEICAQWin图像处理与分析系统，德国。
1.1.2 实验动物 昆明小鼠，雄性，7～8周龄，体重20～25g，小鼠每笼8只饲养，自由进食、饮水。由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 昆明小鼠PD模型的建立 实验组24只，对照组6只。实验组腹腔注射MPTP30mg.kg，对照组注射同等剂量的生理盐水，每天上午8时，连续给药5天。同时实验组24只动物又随机分为4组，每组6只:①GDNF4天组;在制备PD模型的第4天右侧纹状体立体定位注射GDNF;②PBS4天组;在制备PD模型的第4天右侧纹状体立体定位注射PBS;③GDNF6天组;在制备PD模型的第6天右侧纹状体立体定位注射GDNF;④PBS6天组;在制备PD模型的第6天右侧纹状体立体定位注射PBS。
小鼠腹腔内注射10%水合氯醛进行麻醉，按照Paxinos and Watson（1997）图谱选择坐标。坐标为（mm）:P（前囟前），+0.9;L（旁开），-2.0;V（硬膜下），+3.5。用10μl的Hamiton微量注射器抽取液体，注射速度为0.5μl.min，注毕留针5min，并以1mm.min的速度缓慢退出。GDNF溶液以无菌的0.01mol.L PBS配制，其浓度为20μg.L，共1μl，另2组注射相同体积的无菌0.01mol.L PBS。
1.2.2 取材切片 将制备模型后第7天实验各组的6只KM小鼠腹腔内注射10%水合氯醛进行麻醉，经左心插管生理盐水、多聚甲醛灌注固定后取中脑部分后固定。梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。做黑质节段连续冠状切片，片厚6μm，切片分组收集。切好的脑片贴于事先用多聚赖氨酸处理好的玻片上，37℃烘烤过夜，备用。
1.2.3 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，微波修复，0.5%正常羊血清封闭，37℃，30min。依次加入①小鼠抗TH抗体（1∶3000）或小鼠抗CaBP抗体（1∶1000），②生物素结合的羊抗小鼠Ig（1∶50），③辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素卵白素复合物。以上各步骤之间均用0.01mol.L PBS冲洗3次，每次5min。最后用DAB分别对CB和TH进行显色反应。对DAB显色的切片用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.4 计算机辅助图像分析系统进行图像分析 用计算机辅助图像分析系统，在目镜×10物镜×20的倍数下分别对各时相点的TH + 细胞和CB + 细胞进行定量分析。将小鼠每个中脑组织切片从嘴侧至尾侧分为前、中、后3个区域。任意选择带有明显核仁的有清晰轮廓的TH + 神经元或CB + 神经元作为测量对象，测定单位面积内阳性细胞数。
1.3 统计学处理 使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P&<0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 TH免疫组织化学染色结果 TH是多巴胺合成的关键酶，也是多巴胺能神经元的标志酶。本实验以此为指标评价经纹状体注射GDNF对多巴胺能神经元的保护性作用。腹腔注射MPTP12天后，中脑黑质TH阳性神经元数目明显减少，腹腔注射MPTP实验组（33.667±8.383）（n=6），而腹腔注射生理盐水对照组（60.333±10.708），两组相比结果显示有统计学意义（P&<0.01）。GDNF4天组，GDNF6天组，分别与PBS4天和PBS6天组比较，结果显示中脑黑质TH阳性神经元数目不同程度的增加，PBS4天与PBS6天组相比没有统计学意义，以后统称为PBS组，细胞计数结果为:GDNF4天组（54.333±6.919）（n=6），GDNF6天组（75.667±5.391）（n=6），PBS（21.167±4.997）（n=6），有统计学意义（P&<0.01）（图1，2）。同时GDNF4天组与GDNF6天组相比较也有明显的统计学意义（P&<0.01）。总之通过以上的比较，在MPTP损伤早期，在GDNF生理剂量早期变化的不同阶段，经纹状体注射GDNF可能对损伤灶周围受累的DA神经元的生存、结构及功能的恢复起一定的作用。
图1 各组小鼠黑质内TH阳性细胞数的比较（略）
（制备PD小鼠模型的第4天和第6天，纹状体内给予GDNF，存活7天时单因素方差分析，**P&<0.01）
图2 各组小鼠在腹腔给予MPTP的不同时间点，同侧黑质TH免疫组织化学染色（DAB法，bar=10μm）（略）
A.小鼠在腹腔给予MPTP的第4和第6天，单侧纹状体内给予PBS后第7天同侧黑质TH免疫组织化学染色B.小鼠在腹腔给予MPTP的第4天，单侧纹状体内给予GDNF后第7天同侧黑质TH免疫组织化学染色C.小鼠在腹腔给予MPTP的第6天，单侧纹状体内给予GDNF后第7天同侧黑质TH免疫组织化学染色
2.2 CB免疫组织化学染色结果 腹腔注射MPTP12天后，中脑黑质CB阳性神经元数目明显减少，腹腔注射MPTP实验组为19.000±3.286（n=6），而腹腔注射生理盐水对照组为33.167±5.636，两组相比结果显示有统计学意义（P&<0.01）。GDNF4天组、GDNF6天组与PBS组比较，中脑黑质CB阳性神经元数目有不同程度的增加:46.333±5.538，69.667±8.687，21.167±4.997;有统计学意义（P&<0.01）（图3，4）。
（制备PD小鼠模型的第4天和第6天，纹状体内给予GDNF，存活7天时，单因素方差分析，**P&<0.01）
图4 各组模型小鼠制备后的不同时间点，同侧黑质CB免疫组织化学染色（DAB法，bar=20μm）（略）
A.第4天和第6天，单侧纹状体内给予PBS后第7天同侧黑质CB免疫组织化学染色B.第4天，单侧纹状体内给予GDNF后第7天同侧黑质CB免疫组织化学染色C.第6天，单侧纹状体内给予GDNF后第7天同侧黑质CB免疫组织化学染色
3 讨论
PD是一种慢性进行性疾病，在研究其发病机制与药物治疗过程中，建立了合适的PD动物模型。其中比较经典的是6-羟多巴胺（6-OHDA）与MPTP。MPTP本身是无毒副作用的小分子物质，有高度亲脂溶性，易透过血脑屏障，星形胶质细胞、5-羟色胺神经元等细胞摄取后，在单胺氧化酶B（MAO-B）作用下活化，转变为中间代谢物MPFP+，生成有毒性作用的MPP+释放到细胞外间隙，被DA能神经元轴突末梢通过突触前膜DA转运体（DAT）摄取逆向运输到黑质多巴胺神经元胞体，阻止线粒体呼吸链，导致能量衰竭［8-9］ 。随后增加ROS、NO等自由基的释放，反应性胶质细胞增生等引起黑质多巴胺神经细胞的死亡与凋亡［10-11］ 。我们应用MPTP腹腔注射制备模型后1周时，从结果与对照组比较TH，CB阳性神经元数目明显减少，我们以往研究表明在TH，CB阳性神经元的细胞突起的长短、数量、胞体的面积等形态学方面也有明显的差别，证明了我们的模型符合实验的要求，可用于PD细胞病发病机制和治疗策略的研究。
在黑质纹状体系统，胶质细胞系源性神经生长因子是目前研究对DA能神经元有神经营养作用的20多种分子之一。纹状体靶源性胶质细胞系源性神经生长因子在早期的神经发育和机体应激过程中维持黑质DA能神经元的成熟发挥着重要的作用。在体和离体实验已证明其对黑质DA能神经元是潜在的神经营养分子，能阻止黑质DA能神经元进行性变性，从而获得治疗PD的应用价值［12］ 。当前研究表明其神经保护作用可能与体内胶质细胞增殖以及GDNF相关受体启动的信号通路有关［13］ 。而内源性的胶质细胞系源性神经生长因子表达的时程较短，表达增加量有限，难以对受损的神经细胞起到全 面持久的治疗作用。有学者研究发现，脑缺血灶周边区神经元在缺血发生后机体GDNF表达有2个高峰即一个来源于神经元的2h，另一个来源于胶质细胞的第3天［14］ 。我们在MPTP制备PD模型的第4天与第6天，纹状体内给予GDNF，显示TH、CB阳性神经元与对照组之间以及二者之间在胞体的数目、面积、突起长度等有明显的差别。表明经纹状体注射GDNF对DA能神经元有保护和促存活的作用，还能提高神经元的抗损伤能力，且具有促进轴突生长作用。在损伤的早期阶段，随着内源性GDNF剂量的减少，其保护作用更趋明显，为DA能神经元变性的早期治疗时间窗指明了方向。
总之GDNF作为一种结构内环境的营养因子，在PD治疗中的应用具有一定的前瞻性。
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