作者：岳喜军 曹晓建 卜寿山
【摘要】 目的 用Fuminori乙酰胆碱酯酶染色法鉴别脊神经根的性质，并观察脊神经根标本在室温下放置随时间的延长和液氮冷冻次数增加后染色结果的变化，为临床上快速地鉴别周围神经束的性质提供动物实验基础。方法 取4条Beagle犬的T1～S1的所有新鲜脊神经根标本，分为A组和B组:A组标本在室温下每隔1 h做切片，连续8 h，在显微镜下观察染色结果;B组脊神经根取出后迅速保存在液氮里，间隔10 min取出室温下解冻5 min后做病理切片，观察染色结果，连续10次。结果 切片染色0.5 h后运动根出现红棕色染色，感觉根不被染色。室温下放置5 h后及液氮冷冻7次以后的切片，运动根染色明显减弱，切片出现神经标本的脆裂现象。结论 脊神经根的性质可以用Fuminori乙酰胆碱酯酶染色法快速准确地鉴别出来，越是新鲜的标本，染色效果越好。
【关键词】 乙酰胆碱酯酶；脊神经根；鉴别
在周围神经损伤后的神经修复中，难点之一是能否正确分辨出神经干内运动束与感觉束，现有的缝合方法由于不能实现两断端相同神经束正确缝合，严重影响了患者的神经功能恢复。本实验通过改进的Fuminori乙酰胆碱酯酶染色法［1］对脊神经根的染色进行研究，鉴别脊神经根的性质，以期为实现神经两断端相同神经束正确吻合、提高周围神经损伤修复后功能恢复率提供动物实验基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物、仪器、试剂
1.1.1 实验动物 成年Beagle犬4条，雌雄各半，购自爱立默公司。
1.1.2 仪器 CM1900恒温冷冻切片机（德国Leica公司）， PHY-DHS-40X50-RC型恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，CHA显微镜（日本Olympus公司），GB303微量天平（Metteler toldo公司）。
1.1.3 试剂 碘化乙酰硫代胆碱（acetyl cholinesterase iodide， 美国Sigma公司），铁氰化钾(汕头西陇化工厂)，柠檬酸钠(汕头西陇化工厂)，硫酸铜(上海振兴试剂厂)，四异丙基焦磷酸亚胺(tetraisopropyl pyrophosphoramide， 美国Sigma公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 染色原理 用乙酰硫代胆碱作底物， 经过组织中的乙酰胆碱酯酶（AchE ）的水解作用，放出硫代胆碱；硫代胆碱的游离硫氢基将铁氰化物还原成亚铁氰化物，后者再与铜离子形成不溶性的亚铁氰化铜，形成一种棕红色沉淀出现在酶活性部位。由于脊神经前根(运动根)中含有较多的AchE而后根(感觉根)中没有，故前根被染色而后根不被染色，从而达到鉴别的目的。
1.2.2 Fuminori酶组织化学染色法试剂及配制配液顺序:①瓶1加入瓶2，摇荡1～2 min;②管1加入瓶2，混合5～10 s;③管2加入瓶2，混合5～10 s;④瓶2加入瓶3，摇荡5 min;⑤管3加入瓶3，混合5～10 s。
将上述混合液(孵育液)放入45℃温箱中孵育，使孵育液温度保持45℃。
1.2.3 标本制作及染色 取4条Beagle犬的T1～S1的所有新鲜脊神经根标本，分为A组和B组。A组的标本在室温下每隔1 h做切片，连续8 h，每次做完切片都及时染色。B组的脊神经根取出后迅速放在液氮里冷冻，间隔10 min取出室温下解冻5 min后做病理切片，连续10次。制片要求：低温恒冷切片(-20℃)，厚15 μm，标本置于10%甲醛钙液中固定15 min，蒸馏水洗3次，每次１ min。切片在上述孵育液反应0.5 h后，显微镜下观察染色结果及拍照。
Fuminori酶组织化学染色法结果出现较快， 在孵育0.5 h后就可以观察到大部分的脊神经前根神经纤维染色呈红棕颗粒，在室温下保存时间短和液氮冷冻次数少的脊神经前根标本染色更清晰（图1、2）。室温下放置5 h后（图3）及液氮冷冻7次以后（图4）的切片上观察到运动根染色明显减弱，染色结果变差。脊神经后根神经纤维均未出现着色。
3 讨 论
在周围神经损伤后的神经修复中，若能实现神经两断端感觉束对感觉束、运动束对运动束正确吻合，将极大提高神经功能恢复率。因此术中如何快速准确地鉴别周围神经运动束和感觉束，成为显微外科研究中极其关注的难题。目前可供选择的区别神经束性质的方法有较早的形态学的神经束定位图［2］、电刺激法［3］、免疫组化法［4］、计算机三维重建技术［5］等，但各因其自身存在的缺陷和不足而难以在临床上推广应用。如形态学的神经束定位图，因神经损伤后两断端易发生扭转，改变了原来的正常解剖位置而不能准确区别对合；用电刺激法，病人要保持清醒，对陈旧性损伤无反应，因电流扩布的影响准确性差；经典的Karnovesky和Root酶组织化学染色［6］需要时间过长，2 h后才能出现染色结果；免疫组化法缩短了染色时间，但染色前准备过程复杂，假阳性率高，不能满足临床需要。Fuminori酶组织化学染色法通过对孵育液配制的改进，使孵育液更加稳定，提高了酶反应温度，实验结果显示0.5 h出现染色结果。
本实验结果显示：Fuminori酶组织化学染色法可以比较快速地鉴别出神经根的性质，随着神经根标本放置时间的延长及冷冻次数的增加，染色效果变差，提示用于鉴别时新鲜的神经根效果好。本方法从时间角度来说，向临床应用迈进了一大步；但在实用上尚存在需要切取部分神经断端组织及原位对合问题，尚需进一步研究。
【参考文献】
［1］ Kanaya F. Mixed nerve suture facilitated by enzyme-staining techniques［J］. Tech Hand Up Extrem Surg， 2002， 6(3): 140-144.
［2］ Jabaley ME， Wallace WH， Heckler FR. Internal topography of major nerves of the forearm and hand: a current view［J］. J Hand Surg［Am］， 1980，5(1): 1-18.
［3］ Gual JS. Electrical fascicle identification as an adjunct to nerve repair［J］. J Hand Surg［Am］， 1983，8（3）: 289-296.
［4］ 严志强，王友华，张沛云，等.快速免疫组化法区分人周围神经束性质［J］. 中华显微外科杂志，1996，19（1）:3-5.
［5］ 陈增淦，陈统一，张 键，等. 臂丛神经显微结构的计算机三维重建［J］.中华骨科杂志，2004，24（8）：462－466.
［6］ Karnovsky MJ， Roots L. A “direct-coloring” thiocholine method for cholinesterase［J］. J Histochem Cytochem， 1964，12:219-221.转贴于