【摘要】 目的 探讨1，6-二磷酸果糖(FDP)对白细胞介素-1β(IL-1β)损伤胰岛β细胞的保护作用。方法 分离3～5日龄Wistar大鼠胰岛，进行胰岛细胞体外培养，在培养细胞中加入IL-1β及FDP，用紫外分光光度法测细胞内游离钙离子浓度，用火焰原子吸收光谱法测量加入FDP前后细胞的总钙量。结果 在胰岛细胞中加入IL-1β后，细胞内游离钙离子浓度及细胞总钙量均升高；在IL-1β损伤后的胰岛细胞中加入FDP的钠盐共同培养后，细胞内游离钙离子浓度及细胞内总钙量均减少（P&<0.01）。结论 IL-1β引起胰岛β细胞外钙离子内流入细胞内，导致胰岛β细胞内钙超载。加入FDP可抑制IL-1β引起的胰岛β细胞内钙超载，表明FDP对胰岛β细胞有一定保护作用。
【关键词】 胰岛β细胞；白细胞介素-1β；钙超载;1，6-二磷酸果糖
Abstract:Objective To investigate the protective effect of fructose-1，6-diphosphate (FDP) on pancreatic β cells.Methods Pancreas was isolated from three-to-five-day Wistar rats to proceed with cellular culture in vitro. The cytoplasmic free calcium ion concentration was determined by ultraviolet spectrophotometry， the intracellular total calcium by flame atomic absorption spectrophotometry， before and after administration of IL-1β and FDP.Results The intracellular free calcium ion concentration and intracellular total calcium of pancreatic β cells were increased after the administration of IL-1β. After the adding of FDP-Na to the pancreatic β cells damaged by IL-1β， the cytoplasmic free calcium ion concentration and the intracellular total calcium became lower than that in the IL-1β injury group without FDP treatment (P&<0.01).Conclusion Influx of extracellular calcium ions into β cells via voltage-gated calcium channel may induce calcium overload in pancreatic β cells， and FDP can depress this injurious calcium overload， suggesting that FDP could protect βcells from the IL-1β injury to a certain extent.
Key words: pancreatic β cell; interleukin-1; fructose-1，6-diphosphate； calcium overload
1型糖尿病是胰岛β细胞选择性被破坏的自身免疫性疾病，胰岛β细胞的数目减少和（或）功能障碍是其中心环节。β细胞的损伤和死亡是多因素作用的结果，其中细胞因子作为免疫反应的中介者和调节者，在1型糖尿病的发病过程中起着重要作用。近来，白细胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)在胰岛β细胞的损伤中引起了研究者的重视。将小鼠胰岛细胞与大剂量的IL-1β共同培养20 h后，发现胰岛β细胞明显发生凋亡。Ca2+作为细胞内的第二信使，参与和调控着细胞内多种代谢活动，同时也受到细胞严格调控。细胞内Ca2+超载时，线粒体功能受到抑制，ATP产生障碍，同时钙蛋白酶、磷脂酶被激活，直接损伤细胞。钙超载也可损伤胰岛细胞功能，引起β细胞凋亡［1］。 1，6-二磷酸果糖（FDP）是糖酵解的中间代谢产物，能调节细胞代谢过程中某些酶的活性，改善细胞功能［2］，减轻细胞损伤，动物实验表明FDP可改善心﹑脑缺血，有助于低温冷藏后心肌功能的恢复，减轻大鼠肺缺血再灌注引起的急性损伤等。近来发现FDP的保护作用与Ca2+有关，但其确切机制尚待进一步研究。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂 出生3～5天的Wistar大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。IL-1β（北京邦定生物医学公司），RPMI-1640培养液（美国GIBCO公司），小牛血清（杭州四季青生物制剂公司），FDP(重庆医科大学药物化学研究室) ，胶原酶Ⅴ型（美国Sigma公司），Triton X-100(美国Sigma公司) ，Fura-2/AM(Biotium 公司)，Verapamil(美国Sigma公司)
1.2 实验方法
1.2.1 胰岛细胞的分离与培养 出生3～5天的Wistar大鼠20只，无菌取出胰腺，置于RPMI-1640液中清洗后剪碎胰腺，放入盛有Ⅴ型胶原酶溶液（0.5 g/L）的锥形瓶中，消化后用RPMI-1640液清洗离心，加入含15%小牛血清的RPMI-1640培养液，置于CO2培养箱中培养24 h。收集胰岛细胞，调节细胞至1×109个/L。
1.2.2 细胞内游离钙的测定 胰岛细胞分离后置于8个细胞培养瓶培养，随机分为正常对照组、IL-1β损伤组、IL-1β+Verapamil组和IL-1β+FDP组，共4组，每组2瓶。置于CO2培养箱中培养24 h后转入培养板，正常对照组继续加含15%小牛血清的RPMI-1640培养液培养，其余组分别加入IL-1β，使其终浓度为2×104 U/L。20 h后，离心去除IL-1β，重悬后在IL-1β+Verapamil组加入Verapamil至终浓度1 μmol/L， IL-1β+FDP组加入FDP至终浓度为7.5 mmol/L， 30 h后，采用Fura-2/AM荧光法测各组细胞内游离Ca2+浓度，参考McCormack等［3］的方法。
1.2.3 细胞内总钙的测定 将分离培养的胰岛细胞随机分为4组：正常对照组、IL-1β损伤组、IL-1β+Verapamil组和IL-1β+FDP组。正常对照组继续加含15%小牛血清的RPMI-1640培养液培养，其余组分别加入IL-1β，使其终浓度为2×104 U/L，20 h后，离心去除IL-1β，重悬后在IL-1β+Verapamil组加入Verapamil至终浓度1 μmol/L，IL-1β+FDP组加入FDP至终浓度为7.5 mmol/L，30 h后，用无钙液离心、清洗3次。用火焰原子吸收光谱法测定各标本总钙量，其仪器工作参数设定为：吸收波长422.7 nm，灯电流值10 mA，光栅隙缝0.5 nm，火焰Air-C2h3，燃气流速2.0 L/min，助燃气流速8.0 L/min，预雾化时间3 s，进样时间5 s。
1.3 统计学处理 实验结果以±s表示。采用单因素方差分析及两两t检验，P&<0.05表示有统计学差异。
2 结 果
2.1 细胞内Ca2+浓度 给予2×104 U/L IL-1β作用20 h后测定细胞内游离Ca2+浓度，与正常对照组比较，IL-1β损伤组Ca2+浓度明显增加，统计学上有意义（P&<0.01）。加入1 μmol/L Verapamil后，细胞内Ca2+浓度明显下降（与IL-1β损伤组比较P&<0.01），说明在IL-1β损伤胰岛β细胞过程中，细胞外Ca2+有部分从L型电压门控钙通道内流入细胞内。加入7.5 mmol/L FDP加以保护30 h后细胞内Ca2+浓度也显著下降，有统计学意义（与IL-1β损伤组比较P&<0.01）（表1）。表1 细胞内游离Ca2+浓度与正常对照组比较:△P&<0.01；与IL-1β损伤组比较:★P&<0.01
3 讨 论
炎性细胞因子在胰岛β细胞凋亡中起重要作用，其中IL-1β是糖尿病过程中致β细胞损伤的主要免疫因子。单独应用IL-1β即可对胰岛β细胞产生损伤作用。本实验中，用2×104 U/L IL-1β与胰岛细胞共孵20 h后，细胞内Ca2+浓度增加，但不能确定增加的Ca2+是由细胞外内流入胞内还是胞内钙贮存器释放所致。将胰岛细胞与IL-1β共同培养20 h后，去除细胞外钙，再测量细胞总钙量，发现细胞总钙量明显增加， 提示在胰岛细胞与IL-1β共孵过程中，有胞外Ca2+内流入胞内，因此使细胞总钙量增加，但细胞外Ca2+是通过β细胞膜上何种通道内流尚不可知。已知β细胞膜上的Ca2+通道以电压依赖性钙通道为主，分为高电压激活（HVA）钙通道和低电压激活（LVA）钙通道，HVA钙通道又分为对二氢吡啶敏感的L型钙通道和对二氢吡啶不敏感的钙通道［4］。在给予特异L型Ca2+通道阻滞剂Verapamil后，发现Verapamil可抑制钙超载，使Ca2+浓度和钙总量均减少，提示至少有部分Ca2+是从胞外沿L型钙通道内流入β细胞内。但是否有其他途径增加细胞内Ca2+浓度（如cGMP-PKG途径）［5］，有待进一步探讨。
FDP是糖酵解过程的中间代谢产物。已证实FDP能维持细胞内ATP含量，保护细胞膜完整性及稳固脂质双层，减少溶酶体酶及组织活性肠肽的释放，从而对心、脑、肾等各组织的缺血缺氧具有保护作用。实验发现FDP能保护IL-1β损伤的胰岛β细胞，其中以7.5 mmol/L的FDP作用30 h对受损的胰岛β细胞最具保护作用。FDP能影响细胞内钙离子浓度，它能增强ryanodine通道激动剂引起的钙释放，又能抑制IP3和NADPH引起的钙释放，从而调节细胞钙稳态［6］。我们证实FDP在使胰岛β细胞胰岛素分泌功能恢复的过程中，能有效减轻细胞内钙超载，使β细胞内Ca2+浓度由（879.61±34.59） nmol/L下降到（351.62±21.76） nmol/L。因此我们认为FDP能通过降低IL-1β引起的β细胞内钙超载，从而减轻IL-1β引起的胰岛β细胞损伤。
参考文献
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