【关键词】 止哮平喘方
摘要：【目的】探讨中药止哮平喘方(主要由法半夏、瓜蒌皮、薤白、白芍、柴胡、黄芩、麻黄、枳壳、射干、甘草等中药组成)对哮喘豚鼠模型气道炎症的影响。【方法】复制卵蛋白致敏哮喘模型，观察支气管及肺的病理学改变；测量全血及肺泡灌洗液(BALF)中血细胞计数；免疫组织化学法测定外周血单核细胞(PBMC)中CD＋４、CD＋８T细胞的含量。【结果】病理研究显示哮喘模型组豚鼠气道周围大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞(EOS)和淋巴细胞为主。哮喘模型组全血及BALF中炎性细胞数显著高于正常组(Ｐ＜001)；中药大剂量组和西药对照组炎性细胞数均显著降低(Ｐ＜005或Ｐ＜001)。哮喘模型组CD＋４T细胞高于正常组(Ｐ＜005)；中药大剂量组和西药对照组CD＋４T细胞均有下降(与哮喘模型组比较，Ｐ＜005)。【结论】中药止哮平喘方能降低气道及外周血炎性细胞的数量，具有抗气道炎症的作用；降低CD＋４细胞数量，相对增加CD＋8T细胞，使CD＋4/CD＋8恢复正常状态，从而起到调节其紊乱的免疫功能状态的作用，这可能是止哮平喘方抗气道炎症的作用机理之一。
关键词：止哮平喘方/药理学；哮喘/病理学；哮喘/免疫学；嗜酸性细胞； CD4阳性T淋巴细胞；CD8阳性T淋巴细胞；瓜蒌薤白半夏汤/药理学；小柴胡汤/药理学；芍药甘草汤/药理学
支气管哮喘是以嗜酸细胞、淋巴细胞等浸润为主的气道慢性变态反应性炎症，其中淋巴细胞尤其是T淋巴细胞活化起关键作用。现代医学对哮喘的治疗仍然首选糖皮质激素全身或局部用药，但长期应用副作用明显。中药止哮平喘方是王鹏教授多年诊治支气管哮喘的经验方，有宽胸理气、通阳散结、化痰解痉等作用，临床疗效确切。为探讨支气管哮喘气道炎症的病理学特征和止哮平喘方抗气道炎症的作用机制，本实验采用全血及肺泡灌洗液(BALF)中细胞学分析及免疫组织化学方法，评价中药止哮平喘方对哮喘气道炎症的影响及对TH1/Th3型细胞的作用。
1 材料与方法
11 主要试剂及仪器
卵蛋白由Sigma公司出品(进口分装)；016mol/L戊巴比妥钠；肝素用生理盐水配制成1250U/mL的溶液；小鼠抗大鼠SABC试剂盒(即用型)、鼠抗CD＋4及CD＋8多克隆抗体、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物工程公司产品；402超声雾化器，上海四菱医疗机械厂生产。
12 实验动物及分组
清洁级健康豚鼠，体重(200±20)g，由同济医科大学医学动物中心提供。检疫1周后，豚鼠随机分为①正常对照组、②哮喘模型组、③西药对照组、④中药小剂量组、⑤中药大剂量组，共5组，每组10只(雌雄分笼饲养)。
13 造模方法
以卵蛋白致敏和攻击加以复制。实验第1天，配制100g/L卵蛋白生理盐水，豚鼠腹腔注射1mL以致敏；第15天将致敏豚鼠置于14L透明玻璃钟罩内，给予10g/L卵蛋白生理盐水超声雾化吸入(雾化量由小到大)15～20s，后自然吸入15～20s，出现呼吸频率加快、点头呼吸、咳嗽、抽搐等症状时为引喘成功。以后每隔1天以10g/L卵蛋白生理盐水诱喘。按最大雾量，自然吸入15～30s，使哮喘反复发作(每次诱喘之前，每只豚鼠均腹腔注射苯海拉明5mg/kg)。共4次。正常对照组以等量生理盐水进行腹腔注射和雾化，方法同上。
14 药物制备及给药方法
止哮平喘方(由法半夏10g、瓜蒌皮10g、薤白10g、白芍30g、柴胡10g、黄芩10g、麻黄10g、枳壳10g、甘草10g和射干10g组成)由湖北中医学院中药室制备(水煮醇沉法)，含生药2g/mL；地塞米松片，075mg/片，在第1次诱喘24h后，即从第16天开始按1mg・kg－１胃饲给药；中药小剂量组止哮平喘方6g・kg－１；中药大剂量组止哮平喘方24g・kg－１；哮喘模型组及正常对照组均饲以等容量生理盐水。共治疗8d。
15 标本采集及检测
151 标本采集
称体重，016mol/L戊巴比妥钠1mL/kg腹腔内注射，麻醉。常规消毒，心脏采血，肝素抗凝，血细胞计数测定细胞总数，涂片、染色，作细胞学分析。摘取豚鼠肺脏，用无尖针头注射器置于气管分叉处，缓慢注入生理盐水(37℃)2mL，保留30s后抽出，重复4次。每例收集肺泡灌洗液6～7mL(回收率＞85%)，-4℃储存，1h内作细胞分离。BALF于1500r/min离心10min，沉淀细胞用1mL Hanks液重悬。取01mL测定细胞总数；取02mL涂片，WrightGiemsa染色，至少计数200个细胞作细胞分类计数。
152 外周单核细胞(PBMC)的制备和激活
称体重，016mol/L戊巴比妥钠1mL/kg麻醉豚鼠。常规消毒，心脏采血，抗凝。用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，用完全RPMI1640定容细胞并记数。台盼蓝染液检查PBMC活性，活性超过95%。另部分T淋巴细胞置于预先包被了抗CD3单抗的培养板中，37℃、体积分数为5%CO２常规培养24h。
153 免疫组化
按常规步骤操作［１］，设阴性替代片和空白对照显色，阳性细胞表达为棕黄色。免疫组化片每组随机选择5张，在200倍光镜下观察。每张随机选取5个视野，计数200个细胞中阳性细胞所占比例，取其平均值。
154 形态学观察
每组选取右肺中叶以体积分数为10%的市售甲醛固定，常规石蜡包埋行HE染色，观察各组豚鼠支气管、肺组织的形态学改变。
16 一般情况观察
观察实验过程中各组豚鼠的精神、活动、饮食、排便、皮毛及死亡情况。
17 统计分析
所有数据采用(x±s)表示，统计分析采用t检验。
2 结果
21 一般情况
豚鼠致敏后普遍精神较差，活动减少，1～2d后逐渐恢复正常。第3周哮喘模型组3只豚鼠出现皮毛蓬松；西药对照组有1只脶鼠，中药小剂量组有2只豚鼠出现明显皮毛蓬松现象。最后1次诱喘时，哮喘模型组1只豚鼠哮喘发作严重，经给氧抢救后无效死亡；正常对照组豚鼠情况良好，无死亡；各给药组豚鼠情况均较哮喘模型组明显改善。
22 各组豚鼠全血细胞计数与分类
表1结果表明，哮喘模型组全血中总细胞(blood cells，BC)浓度显著高于正常对照组(Ｐ＜001)；中药大剂量组和西药对照组总细胞浓度显著降低(Ｐ＜005)；哮喘模型组嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)、淋巴细胞(lymphocytes)均高于正常对照组(Ｐ＜001)；中药大剂量组及西药对照组EOS、淋巴细胞均显著降低(Ｐ＜005)。表1各组豚鼠全血的白细胞计数与分类（略）
23 各组豚鼠BALF中细胞计数与分类
表2结果表明，哮喘模型组BALF中总细胞浓度显著高于正常对照组(Ｐ＜001)；中药大剂量组和西药对照组总细胞浓度显著降低(Ｐ＜001)；哮喘模型组EOS、淋巴细胞均高于正常对照组(Ｐ＜001)；中药大剂量组及西药对照组EOS、淋巴细胞均显著降低(Ｐ＜001)。表2 各组豚鼠BALF中白细胞计数与分类（略）
24 各组豚鼠PBMC中CD＋４、CD＋８T细胞数量变化
表3结果表明，哮喘模型组CD＋４T细胞数量较正常对照组显著升高(Ｐ＜005)，CD＋8T细胞数量无明显变化(Ｐ＞005)；中药大剂量组和西药组均能降低CD＋４T细胞数量(P＜005)，而对CD＋８T细胞数量影响不明显(P＞005)。提示中药大剂量组可降低CD＋４T细胞数量。表3 各组豚鼠PBMC中CD＋４、CD＋8T细胞数量变化（略）
25 各组豚鼠形态学观察
光镜下正常对照组：支气管、肺组织结构正常，各级支气管上皮完整，炎性细胞浸润少见(图1-a)；哮喘模型组：气道炎症明显，在细、小支气管管壁和伴行动脉周围有大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，其中以嗜酸细胞为主，严重者可见脱落的上皮细胞。支气管管腔狭窄，杯状细胞增生明显，平滑肌增厚；部分肺泡壁变薄或断裂，融合成肺气肿(图1-b)；西药对照组：病理变化基本接近于正常组，支气管及肺组织结构基本正常。与模型组相比，支气管及肺泡区炎性细胞浸润明显减少(图1-c)；中药小剂量组：病变与哮喘模型组比较，炎性细胞浸润略有减少(图1-d)；中药大剂量组：支气管及肺组织结构基本正常。与模型组相比，气道炎性细胞浸润显著减少，与西药对照组比较无显著差异(图1-e)。 3 讨论
在哮喘气道慢性炎症中，大量的炎性细胞(如嗜酸细胞、淋巴细胞等)和多种炎性介质参与其病理过程。其中嗜酸细胞(EOS)和淋巴细胞与之尤为密切［２］。目前认为EOS是气道变应性炎症反应的主要效应细胞。因此，有人称哮喘为“慢性嗜酸细胞性哮喘”［３，４］。
淋巴细胞活化是哮喘病人免疫功能紊乱的主要特征。研究发现：①哮喘患者支气管活组织检查及外周血和BALF中CD＋４淋巴细胞增多；②激活的T淋巴细胞通过特殊的淋巴因子参与哮喘的慢性炎症反应。如促使嗜酸细胞趋化、增殖、分化及功能激活，从而加强气道组织中嗜酸细胞的致炎作用［５］。
在哮喘气道慢性炎症中，T细胞尤其是CD＋４辅助性T细胞过度活化是关键，起核心作用。在哮喘发病中免疫功能的失调主要表现在：CD＋４细胞的活性增强和CD＋8细胞的功能降低。所以CD＋４细胞(TH２)在哮喘发病中起重要调控作用，而CD＋8细胞也参与哮喘的发病。在这一炎症过程中，TH２型细胞反应占优势是其重要特征。因此有人提出所谓的哮喘“TH２细胞假说”。在哮喘发病时，CD＋４/CD＋8细胞经常处于失衡状态。因此，通过检测CD＋４、CD＋8细胞的含量变化可以观察哮喘免疫功能情况。
本实验表明，哮喘模型组血液循环及气道局部BALF中均存在大量炎性细胞浸润，炎性细胞主要以嗜酸性细胞和淋巴细胞为主。病理学亦证实哮喘模型组的气道炎症明显，在细、小支气管管壁和伴行动脉周围有大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，其中以嗜酸细胞为主。同时，CD＋４/CD＋8T细胞经常处于失衡状态，即CD＋４细胞的活性增强和CD＋8细胞的功能降低。治疗后，中药小剂量组炎性细胞改变不明显；中药大剂量组和西药对照组炎性细胞显著降低。说明止哮平喘方能降低外周血炎性细胞如EOS、淋巴细胞等的数量；进一步研究证明，中药大剂量组CD＋４细胞较哮喘模型组下降，说明其能降低CD＋４细胞含量，使CD＋４/CD＋8T细胞经常处于平衡状态。
我们认为哮喘发作时的主要病理环节是痰阻气闭、痰气互结、胸阳不振、气道挛急，故拟宽胸理气、通阳散结、化痰解痉等多法联用、整体调节，创制止哮平喘方。全方为瓜蒌薤白半夏汤、小柴胡汤、芍药甘草汤等3首方剂化裁而得，由瓜蒌、法半夏、柴胡、黄芩、射干等10味中药组成。现代药理学研究表明：瓜蒌皮所含的氨基酸有良好的祛痰作用；薤白有良好的平喘作用，可能与其改善肺通气功能、尤其是小气道功能，提高前列腺素类(PGI２)的含量、抑制血栓素A２(TXA２)的生成以及抗自由基效应有关［６］。研究证实以射干、麻黄为主组成的方剂的作用机理与调节环核苷酸水平有关，主要使cAMP含量及cAMP/cGMP比值上升，cGMP含量下降，从而使支气管平滑肌松驰，并抑制介质释放而具平喘作用［７］。麻黄碱为β２受体激动剂，具有显著的平喘作用，对支气管平滑肌痉挛有较持久的解痉作用，尤其对支气管平滑肌处于痉挛状态时作用更显著。
本实验结果表明，中药止哮平喘方能够降低外周血炎性细胞如EOS、淋巴细胞等的数量，从而减少炎性细胞向气道内聚集的可能性；更重要的是能抑制炎性细胞在气道局部内的浸润，即降低BALF中炎性细胞的数量，减轻其毒性产物的损伤及气道高反应(AHR)的形成［８］，具有抗气道炎症的作用。进一步研究显示止哮平喘方能通过降低CD＋４细胞数量，相对增加CD＋8细胞，使CD＋４/CD＋8细胞恢复正常状态，从而调节其紊乱的免疫功能状态。这可能是止哮平喘方抗气道炎症的作用机理之一。
参考文献
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