作者：全世建，李政木，谢桂权，张丽君
【关键词】 猪苓汤
摘要：【目的】探讨猪苓汤治疗原发性系膜增殖性肾炎的作用机制。【方法】采用兔抗鼠胸腺细胞抗体(Thy-1)大鼠肾炎模型，检测各组大鼠血液生化指标和细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的活性以及白细胞介素6信使核糖核酸(IL-6?mRNA)的表达波。【结果】模型组的IL-1β、TNF-α和IL-6水平均升高，IL-6?mRNA表达增强，与正常对照组比较有显著性差异(Ｐ＜001)；猪苓汤组能降低IL-1β、TNF-α和IL-6的水平及减弱IL-6?mRNA的表达，与模型组比较均有显著性差异(Ｐ＜005或Ｐ＜001)。【结论】加味猪苓汤可能是通过抑制细胞因子的基因表达、降低细胞因子的活性对原发性系膜增殖性肾炎产生治疗作用。
关键词：肾小球肾炎，膜增生性/中药疗法；细胞因子类； RNA，信使；加味猪苓汤/治疗作用；疾病模型，动物；大鼠
猪苓汤出自《伤寒论》，是张仲景为阴虚水热互结证而设。该方虽然只有猪苓、茯苓、泽泻、滑石、阿胶五味药物组成，却能集滋阴、清热、利水三法于一方，立法与处方极为严谨，临床疗效确切。中医研究认为系膜增殖性肾炎的病机多为阴虚湿热互结，该病的病机与猪苓汤证相似［1］，猪苓汤治疗原发性系膜增殖性肾炎有一定理论依据，并在临床上取得了一定的疗效，为此我们对加味猪苓汤的作用机制进行了研究。
1 材料与方法
11 实验材料
111药物
加味猪苓汤(猪苓、茯苓、泽泻、滑石、阿胶、丹参、益母草、白茅根)中生药均购于广州中医药大学第一附属医院，经广州中医药大学鉴定教研室鉴定。饮片洗净后，加水适量，浸泡60?min，煎煮40?min，滤出药液，浓缩成200?g/L备用；肝素注射用剂，购于天津市力生制药厂，批号：980708；卡介苗购于卫生部成都生物制品研究所，批号：980307；完全弗氏佐剂购于广州威佳公司，批号：9007812。
112 动物
雄性SD大鼠50只，体重150?g左右，购于第一军医大学实验动物中心，合格证号：99A046；雄性新西兰大(NZW)白兔5只，购于第一军医大学实验动物中心，合格证号；99A049。
113 材料
血清肌酐试剂盒由北京中生生物工程高技术公司提供，批号：9807170；血尿素氮试剂盒购于卫生部上海生物制品研究所，批号：T1384-94；白细胞介素1β(IL-1β)放射分析测定盒，批号：RH-73，肿瘤坏死因子α(TNF-α)放射免疫试剂盒，批号：RH-059-50，均由北京北方生物技术研究所提供；白细胞介素6(IL-6)放免药盒，批号：F07，由东亚免疫技术研究所提供；RNA分离试剂盒，批号：25110，反转录试剂盒，批号：189642，均由Promega公司提供；PCR扩增仪，美国PE2400型；Leica Q500型图象分析系统；代谢笼由广州中医药大学动物中心提供。
12 造模方法
采用陈氏Thy-1抗血清制备及系膜增殖性肾炎模型的建立方法［2］，通过分离大鼠胸腺细胞，免疫家兔，制得兔抗大鼠Thy-1抗血清(ATS)，连续4次注射ATS，建立改进型大鼠系膜增殖性肾炎模型。
121 兔抗Thy-1抗血清制备
大鼠胸腺细胞悬液制备：SD大鼠5只，麻醉后取胸腺，剪碎并挤出胸腺细胞，经尼龙网过滤，除去混杂的组织，滤液即为淋巴细胞悬液；离心，无菌PBS悬浮，计数悬液中淋巴细胞数，调节细胞浓度至1×10１１/L。
122 免疫家兔
先用卡介苗3?mL在雄性NZW大白兔背、项、四足掌皮下多点注射进行预致敏，2周后NZW大白兔两侧窝淋巴结肿大，此时在NZW大白兔背部皮下注射抗原(胸腺细胞+完全弗氏佐剂，以等体积的生理盐水和完全弗氏佐剂把胸腺细胞稀释至1×10１０/L，每只兔注射3×107个细胞。3周后经耳缘静脉注射同样剂量再次免疫家兔，5周后相同途径和剂量进行第3次免疫，第6周测效价，达预定值后颈动脉放血，收集血清，经56?℃，30?min灭活补体，大鼠肝粉吸附，备用。
123 ATS(兔抗大鼠Thy-1抗血清)组织效价测定
第6周时，从兔耳缘静脉取血2?mL，测定血清抗胸腺细胞抗体的效价。方法如下：分离大鼠胸腺细胞，用生理盐水稀释至1×1010/L，取1滴细胞悬液滴于干净玻片上，体积分数为95%的酒精固定5?min，吹干；将正常兔血清、抗血清原液、及其1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160的稀释液各80?μL滴加在胸腺细胞片上，均匀散开，37?℃孵育40?min后，PBS冲洗(001?mol/L，pH74)；再加抗兔IgG荧光抗体(效价1∶10)，37?℃孵育40?min，PBS冲洗。当效价大于1∶80(即1∶80稀释液仍有较强染色)后将兔放血，离心，血清保存于-4?℃。
124大鼠Thy-1肾炎模型的制作
大鼠30只，尾静脉注射ATS，每周1次，连续4周。
13 分组及给药方法
131 分组
实验大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组，即正常对照组、模型组，肝素治疗组，猪苓汤治疗组，每组大鼠10只。
132给药方法
正常对照组由尾静脉注射生理盐水10?mL/kg，每周1次，连续4周，同时灌服生理盐水1?g/kg；模型组由尾静脉注射ATS 10?mL/kg，每周1次，连续4周，同时每天灌服生理盐水1?g/kg；肝素治疗组由尾静脉注射ATS 10?mL/kg，每周1次，连续4周，同时从第1周开始，每天腹腔注射肝素2?mg，连续4周；中药治疗组由尾静脉注射ATS 10?mL/kg，每周1次，连续4周，同时从第1周开始，每天灌胃猪苓汤1次(1?g/kg)，连续4周。
14 统计方法
计量资料方差齐用t检验，方差不齐用t′检验，采用SPSS 80统计软件处理。
21 血液
给药4周结束后每组动物眼眶静脉取血，每只8?mL。
211 测定方法
血清肌酐(SCr)采用碱性苦味酸法；血尿素氮BUN用乙二肟一硫氨胍法。
212 结果
见表1。表1 加味猪苓汤对大鼠血清肌酐和尿素氮含量的影响（略）
22 尿液
给药结束时以代谢笼收集各组大鼠的24?h尿，加入二甲苯作为防腐剂。
221 测量方法
尿红细胞定量采用光镜镜检；尿蛋白定量采用磺基水杨酸比浊法。
222 结果
见表2。表2 加味猪苓汤对大鼠尿红细胞和尿蛋白的影响（略）
23 肾脏
第4周处死大鼠，在低温无菌条件下，快速取出大鼠肾脏，-80?℃冰箱保存。
231 实验方法
肾脏病理切片采用苏木素伊红染色(HE)和组碘酸雪夫反应染色(PAS)；细胞因子活性测定(肾小球系膜细胞)以放射免疫法(radio immunoassay，RIA)；肾组织IL-6?mRNA表达采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。
232结果
肾小球细胞数(Ncell，glomerulus)和肾小球直径(dglomerulus)以随机选取25个细胞，取其平均值表示；IL-6?mRNA以IL-6/β-actin表示。表3 加味猪苓汤对肾小球细胞数、肾小球直径的影响（略）表4 加味猪苓汤对IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-6?mRNA的影响（略）
3 讨论
据统计，原发性慢性肾小球肾炎的主要病理类型是系膜增殖性肾小球肾炎(包括IgA肾病)，约占我国原发性肾小球病理类型的666%［3］。非IgA肾炎则占病检患者中的415%。系膜增殖性肾炎是原发性肾小球疾病中最常见的类型，其病理特征主要为肾小球系膜细胞增生和系膜外基质增加［4］。该病发病率高，危害性大，其发病机制还不十分清楚。最近研究发现，细胞因子，特别是IL-6、TNF-α、IL-1β在发病中占有重要的地位，通过降低相关细胞因子活性来抑制系膜细胞增生和系膜外基质增加具有重要意义［5］。
本实验选择Thy-1肾炎模型，因该模型是目前国内外公认的系膜增殖性肾炎模型，造模时间短，症状典型［６］。陈氏Thy-1肾炎模型在原模型基础上改良，增加完全弗氏佐剂增强免疫，缩短造模时间。选择肝素作为阳性对照，因其在体外能明显抑制系膜细胞增殖［７］；在抗Thy-1动物模型中也证实：它不仅能有效抑制系膜细胞增殖，而且能抑制系膜外基质合成，是一种有效治疗系膜增殖性肾炎的药物［８］，肾上腺皮质激素与肝素联合使用，疗效并不优于单独肝素治疗［９］。
实验结果表明，模型组肾小球系膜细胞增殖和系膜外基质增加明显，同时伴血尿、蛋白尿，肾功能有一定的损害，说明造模是成功的。模型组与正常对照组比较，系膜细胞IL-1β、IL-6、TNF-α活性增加，IL-6?mRNA表达增强。这一结果进一步证实，上述3种细胞因子在系膜增殖性肾炎的发病中起重要作用。
本实验选择血肌酐、尿素氮、尿红细胞、尿蛋白作为大鼠系膜增殖性肾炎模型肾功能检测指标。结果显示，猪苓汤和肝素均能有效抑制系膜细胞增生，降低血肌酐、尿素氮，减轻血尿和蛋白尿症状，减缓肾功能的损害；均能减低IL-1β、IL-6、TNF-α的活性，表明猪苓汤和肝素可能是通过降低这3种细胞因子的活性来达到抑制肾小球病变，改善肾功能的目的。孙氏［１０］认为IL-6是系膜细胞自分泌的重要因子之一，系膜细胞内IL-6?mRNA表达量与系膜扩张、增殖程度及尿蛋白排泄量相关。猪苓汤治疗组可以抑制IL-6?mRNA的表达，猪苓汤是否通过抑制细胞因子的基因表达而达到抑制细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)活性的目的，有待进一步研究证实；肝素治疗组与模型组比较，IL-1β、IL-6、TNF-α分泌均有所下降，但IL-6?mRNA表达无显著性差异，提示肝素对细胞因子作用机理与猪苓汤有所不同，可能是通过其他途径，需进一步研究明确。
参考文献
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［９］孙林，叶任高，曾丽霞，等．系膜增殖性肾炎患者肾小球细胞IL-6、GP130和JunB的mRNA表达及意义［Ｊ］．中华肾脏病杂志，1998，14(1)：3．
［１０］黎磊石，关天俊，刘志红，等．4 298例成人肾小球肾病病理类型及流行病学特点［Ｊ］．肾脏病与透析杂志，1997，2：103．