衰老对小鼠脾CD4+CD25+T细胞的影响

　　　　作者：王弘珺 李质馨 田洪艳 徐冶 朱辛为 杨柳

【摘要】 目的 比较年轻鼠和老年鼠脾CD4+CD25+T细胞的数量及功能变化。方法 采用流式细胞分析法，检测脾CD4+CD25+ T细胞比例及其Foxp3和GITR表达;通过3HTdR掺入测定脾CD4+CD25+T细胞的功能。结果 老年鼠脾CD4+CD25+T细胞的百分数明显增加，但是其抑制功能明显降低，并且表面GITR表达降低。结论 随着年龄的增加，小鼠脾CD4+CD25+T细胞抑制功能降低。

【关键词】 CD4+CD25+T细胞;年龄;Foxp3;GITR

天然CD4+CD25+调节性T细胞在免疫反应中起抑制作用，维持机体对自身和外来抗原的免疫耐受〔1，2〕，其发育和功能受Foxp3控制〔3，4〕，其抑制功能与细胞表面表达GITR等分子有关〔5〕。近几年，这群细胞在自身免疫性疾病中的作用已经引起广泛关注。自身免疫性疾病常见于中老年人，随着年龄的增加，天然CD4+CD25+调节性T细胞发生了哪些变化尚不完全清楚。本文通过研究衰老小鼠CD4+CD25+T细胞的变化，探讨年龄对机体免疫功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选取3个月(青年组)和20个月(老年组)的SPF级Balb/C雌性小鼠，购自北京维通利华公司。

　　1.2 试剂与仪器 荧光标记的抗小鼠CD4、CD25、GITR单克隆抗体及同型对照抗体(BD)，荧光标记的抗小鼠Foxp3单克隆抗体(eBioscience)，丝裂霉素C(MMC，Kyowa Hakko)，3HTdR(北京原子能研究所)，流式细胞仪(BD)，液闪仪(LKB)。

　　1.3 取材 取小鼠脾，制备单细胞悬液，裂解红细胞后，悬浮于PBS中，计数。

　　1.4 免疫荧光染色及FCM分析 将细胞用CY5抗小鼠CD4抗体、FITC抗小鼠CD25抗体、PE抗小鼠GITR抗体或PE抗小鼠Foxp3抗体或同型对照抗体染色，上机，收集3×104细胞/样品，用Cell Quest软件分析数据。

　　1.5 纯化细胞 采用免疫磁珠(Miltenyi)纯化CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞，流式细胞仪检测纯度>95%。

　　1.6 CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用 将CD4+CD25-T细胞(8×104细胞/孔) 和C57BL/6或C3H小鼠的脾细胞(刺激细胞，MMC预处理，8×104细胞/孔)接种于96孔培养板，再加入CD4+CD25+T细胞(4×104细胞/孔)。继续培养至96 h，结束前16 h每孔添加1 μCi 3HTdR，以细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维膜上，液体闪烁测定cpm值。

　　1.7 统计学分析 结果用x±s表示，统计方法为t检验。

　　2 结 果

　　2.1 脾CD4+CD25+T细胞的变化 用CY5抗CD4抗体和FITC抗CD25抗体标记细胞，老年组脾CD4+CD25+T细胞的百分数(6.07±1.03)%明显高于青年组(3.90±1.18)%(P<0.01)。

　　2.2 脾CD4+CD25+T细胞抑制功能的变化 将两组的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞进行交叉实验，两组的CD4+CD25+T细胞均可以抑制青年组CD4+CD25-T细胞增殖，且无明显差异;但是老年组CD4+CD25+T细胞对自身CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用明显降低(P<0.01)。见图1。

　　图1 脾CD4+CD25+T细胞功能的比较

　　2.3 脾CD4+CD25+T细胞Foxp3和GITR表达的变化 两组CD4+CD25+T细胞中Foxp3表达无明显变化，但老年组CD4+CD25+T细胞表面GITR低于青年组(P<0.05)。见表1。表1 CD4+CD25+T细胞中Foxp3+T细胞和GITR+T细胞的百分数与老年组比较:1)P<0.05

　　3 讨 论

　　天然CD4+CD25+调节性T细胞调节机体的免疫反应，维持免疫系统平衡状态。已有研究证实Ⅰ型糖尿病的发生与CD4+CD25+调节性T细胞异常相关〔6，7〕。本文比较了年轻鼠和老年鼠脾CD4+CD25+T细胞的数量及功能变化。

　　流式细胞仪结果表明，老年鼠脾CD4+CD25+T细胞的百分数明显增加，但两组CD4+CD25+T细胞中Foxp3表达无明显变化。说明脾CD4+CD25+T细胞增加并不是由于Foxp3表达升高而引起。实验中使用的SPF级小鼠未接触外来抗原，脾CD4+CD25+T细胞可以看做天然CD4+CD25+调节性T细胞，主要来源于胸腺。随着年龄的增加，胸腺中CD4+CD25+T细胞的百分数明显增加，这是脾CD4+CD25+T细胞百分数增加的主要原因〔7〕。

　　检测CD4+CD25+T细胞的功能变化时，在老年鼠CD4+CD25-T细胞增殖反应中，加入老年鼠CD4+CD25+T细胞后，抑制作用不明显，说明随增龄CD4+CD25+T细胞的抑制功能降低。同时发现老年鼠CD4+CD25+T细胞能够抑制年轻鼠CD4+CD25-T细胞的增殖反应，但对自身CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用明显降低，提示老年鼠CD4+CD25-T细胞对于其自身的CD4+CD25+T细胞不敏感。天然CD4+CD25+调节性T细胞的抑制功能是接触依赖性的，GITR表达于细胞表面，与其抑制功能有关〔8〕。老年鼠CD4+CD25+T细胞表面GITR低于年轻鼠，可能与其抑制功能降低有关。已有研究显示，老年鼠CD4+CD25-T细胞反应性低于年轻鼠〔9〕。

　　虽然老年鼠脾CD4+CD25+T细胞百分数明显增加，但其抑制能力明显降低，并且自身CD4+CD25-T细胞对于自身CD4+CD25+T细胞不敏感。CD4+CD25+T细胞在维持体内的免疫耐受中起关键作用，随着年龄的增加CD4+CD25+T细胞功能降低，如果机体不能维持免疫系统的平衡状态，将加速自身免疫性疾病的发生。

参考文献

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　　9 Shimizu J，Moriizumi E.CD4+CD25-T cells in aged mice are hyporesponsive and exhibit suppressive activity〔J〕.J Immunol，2003;170(4)：167582.