人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立

　　　　　　 作者：杨旭芳何 旭 何 牮 张慕蕊 张丽红 李玉林

【摘要】 目的 探讨人脂肪干细胞(human Adiposederived stem cells，hADSCs)体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系。方法 利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs，分3组分别进行内皮诱导：即纤维连接蛋白(fibronectin，FN)包被组、明胶包被组和未铺组;同时诱导液分为两组：单纯内皮细胞生长培养基(EGM2MV)组及内皮细胞生长培养基(EGM2MV)+50 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF165)组。诱导15 d后，通过流式细胞术检测各组内皮细胞特异性表面抗原CD34的表达;通过相差显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征。结果 体外分离、培养出高度同源性的hADSCs，CD29、CD44、CD90、CD105及CD166呈阳性表达，而CD34、CD45及HLADR呈阴性表达;诱导后细胞流式结果显示单纯EGM2MV诱导的3组细胞内皮细胞特异性标志CD34阴性表达，而EGM2MV+50 ng/ml VEGF165诱导的细胞，其中FN包被组CD34表达率为8.4%，明胶包被组为5.4%，未铺组为4.2%;相差显微镜下可见诱导后细胞呈三角形或多边形，融合处呈铺路石样生长。结论 FN作为细胞外基质与EGM2MV+50 ng/ml VEGF165组成的诱导液协同作用，构成了hADSCs体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系，可为临床上缺血性疾病的自体细胞移植治疗提供大量的种子细胞来源。

【关键词】 人脂肪干细胞;流式细胞术;内皮分化;诱导体系

　　【Abstract】 Objective To discuss the best method for endothelial differentiation of human adiposederived stem cells (hADSCs). Methods hADSCs were isolated from human adipose tissue by collagenase digestion and adherence to flasks， pided into three groups and induced into endothelia respectively， including Fibronectin (FN)coated， gelatincoated group and noncoated group. At the same time， inducing medium was pided into pure endothelial cell growth medium (EGM2MV) and endothelial cell growth medium (EGM2MV) +50 ng/ml vascular endothelial growth factor (VEGF165) groups. After induced 15 d， CD34，which was endothelial cellspecific surface antigen， was detected by flow cytometry. General morphological characteristics of hADSCs and induced hADSCs were observed by phasecontrast microscope. Results A high degree of homology and the CD34 negative hADSCs were succeed to isolate and cultivate. At the end of differentiation， flow results of the three groups induced by simple EGM2MV all showed CD34 negative expression， but the other three groups induced by EGM2MV plus 50 ng/ml VEGF165 showed that CD34 expression rate of FNcoated group was 8.4%， gelatincoated group was 5.6%， notcoated group was 4.2%; Induced hADSCs were triangular or polygonal， paving stonelike growth was observed at the place of local integration. Conclusions Combination of FNcoated and EGM2MV +50 ng/ml VEGF165 is the best method for endothelial differentiation of hADSCs. The results will offer abundant of seeding cells for autologous cell transplantation therapy of ischemic disease.

　　【Key words】 Human adiposederived stem cells (hADSCs); Flow cytometry; Endothelial differentiation; Induction system

　 缺血性疾病是当今世界的常见病之一，尤以动脉粥样硬化性血管疾病为主要代表。目前常用的药物疗法不能彻底解决已经发生狭窄的血管解剖结构，而动脉搭桥术又面临着远期通畅率不够理想等问题，因此寻找新的治疗方法和移植材料已成为晚期缺血性疾病研究的重要课题。近年来随着干细胞研究的进展，将干细胞作为种子细胞为缺血组织血管新生(vasculogenesis)提供了新机遇〔1，2〕，但如何便捷有效地获取种子细胞，是影响组织工程血管应用于临床的一个重要问题。本实验旨在探讨人脂肪干细胞(human Adiposederived stem cells，hADSCs)向内皮分化的最佳诱导体系，为临床上各种晚期缺血性疾病患者提供取材方便、适于体外大量培养增殖、无免疫原性的可供自体移植的种子细胞。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 LGDMEM、10%优质胎牛血清(Hyclone，USA)，0.25%胰酶、胶原酶Ⅰ(Invitrogen)，小鼠抗人单克隆抗体CD44、CD90及CD166(BD，USA)，小鼠抗人单克隆抗体CD29、CD105、CD34、CD45、HLADR(BioLegend，USA)，EGM2MV(Lonza，USA)，VEGF165(Peprotech，USA)。

　　1.2 hADSCs的分离与培养及鉴定

　　1.2.1 hADSCs的分离与培养 整形外科获得的脂肪组织，用无菌PBS液反复冲洗，仔细分离除去结缔组织和血管，最后剪成1 mm3大小的碎块。用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化60 min〔3，4〕，获得的细胞用条件培养基(LGDMEM、10%FBS、100 U/ml penicillin，100 μg/ml streptomycin)重悬〔5〕，37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养，48 h后首次换液，以后每隔3 d更换1次培养基，待细胞长到培养皿底面积80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以下实验均取自P2代hADSCs。

　　1.2.2 hADSCs的表型鉴定 消化收集hADSCs，每组取2×105个细胞，与小鼠抗人单克隆抗体CD29、CD44、CD90、CD105、CD166、CD31、C45及HLADR(1∶100稀释)室温孵育30 min，与 FITC标记的二抗(1∶50稀释)，4℃避光孵育20 min，用300 μl PBS重悬，流式细胞仪检测。

　　1.3 hADSCs内皮诱导体系的探索 利用细胞因子及细胞外基质等因素诱导hADSCs向内皮细胞分化。为了探讨细胞因子及细胞外基质对hADSCs向内皮细胞分化的影响，实验共分6组，分别为纤维连接蛋白(FN)包被与单纯内皮细胞生长培养基(EGM2MV)诱导组;FN包被与EGM2MV+50 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF165)诱导组;明胶包被与单纯EGM2MV诱导组;明胶包被与EGM2MV+50 ng/ml VEGF165诱导组;无包被与单纯EGM2MV诱导组;无包被与EGM2MV+50 ng/ml VEGF165诱导组。hADSCs按照2×103个/cm2细胞密度接种，每隔3 d换液，诱导15 d。

　　1.4 hADSCs内皮诱导后表型鉴定 内皮诱导结束后，消化收集细胞，分别与小鼠抗人单克隆抗体CD34(1∶100稀释)室温孵育30 min，与 FITC标记的二抗(1∶50稀释)4℃避光孵育20 min，用300 μl PBS重悬，流式细胞仪检测。

　　1.5 hADSCs内皮诱导后形态学特征 内皮诱导4、15 d及诱导结束消化重铺后，分别进行相差显微镜下观察、照相。

　　2 结 果

　　2.1 hADSCs的分离与培养及鉴定 激光共聚焦显微镜下可见：典型hADSCs呈成纤维细胞样，胞体狭长，呈长梭形，排列有序，有一定的方向性，呈鱼群样生长。流式细胞仪检测结果显图1 内皮诱导后流式细胞仪检测CD34图2 内皮诱导过程中不同时段细胞形态学特点(×100)

　　示P2代hADSCs呈CD29、CD44、CD90、CD105及CD166阳性，而CD34、CD45及HLADR阴性，纯度在95%以上，具有高度同源性。

　　2.2 hADSCs内皮诱导体系的建立 如图1所示，流式细胞仪检测结果显示单纯用EGM2MV诱导的3组细胞，内皮细胞特异性标志CD34均阴性表达，而EGM2MV+50 ng/ml VEGF165诱导的细胞，其中表达率分别为无包被组为4.2%、明胶组5.4%、FN包被组8.4%。由此确定内皮诱导的最佳体系为FN包被+EGM2MV+50 ng/ml VEGF协同诱导。

　　2.3 hADSCs内皮诱导后的形态学特征 如图2所示，内皮诱导过程中不同时段，相差显微镜下观察可见：①未诱导的hADSCs，呈长梭形、鱼群样排列;②内皮诱导4 d，可见大部分细胞由长梭形逐渐收缩变短，变为多角形，细胞有呈铺路石样生长趋势;③内皮诱导15 d，细胞呈复层生长;④阳性对照细胞人脐静脉血管内皮细胞，细胞呈典型的上皮样细胞形态特点即三角形或多边形，融合处呈铺路石样生长;⑤内皮诱导15 d的细胞消化后重铺，可见细胞形态变为三角形或多边形;⑥融合处呈铺路石样生长。

　　3 讨 论

　　缺血性疾病新血管生成(neovascularization)有两种方式〔6〕:血管新生(angiogenesis)和血管形成(vaseulogenesis)。前者是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管;后者是指在原来没有血管系统的情况下，通过血管内皮祖细胞和造血干细胞产生血流的新通道。国外学者应用内皮祖细胞治疗心肌缺血、脑缺血、下肢缺血等方面的研究，已取得了令人鼓舞的效果〔7〕。但由于内皮细胞获取困难，且为终末分化细胞，不能大量扩增，不能满足移植所需，故选择一种临床上易取得、容易体外培养扩增、并且其分子结构和功能与正常血管内皮细胞相似的种子细胞已成为血管组织工程的研究热点。

　　由于干细胞具有高度增殖、多向分化能力，使得其在这一领域的研究备受关注。与人们熟悉的胚胎干细胞及骨髓间充质干细胞(MSC)相比，hADSCs具有来源广泛、易分离获取、不受伦理道德束缚等优势，因此以hADSCs作为组织工程种子细胞，探讨其向内皮分化的最佳诱导体系，对于临床上晚期缺血性疾病的自体移植治疗具有重要意义。

　　细胞的分化过程受细胞外基质及细胞因子的影响，鉴于此，本实验共设计了6组，结果表明FN作为细胞外基质与高浓度的VEGF及EGM2MV协同，对于内皮分化起到了至关重要的作用。具体机制还不清楚，有待进一步研究。但不同基质与诱导液成分的比较结果显示最佳的内皮诱导体系为FN包被+EGM2MV+50 ng/ml VEGF的联合应用，诱导率高达8.4%。而既往的研究中并没有关于CD34阴性的hADSCs内皮诱导率的报道。笔者获得的hADSCs内皮细胞特异性标志CD34阴性表达，说明无内皮细胞污染。同时主要组织相容性复合物HLADR阴性表达，提示了hADSCs作为同种异体移植的潜力。

　　内皮诱导结束后消化重铺细胞，通过相差显微镜观察诱导前后的hADSCs，直观地看到hADSCs由诱导前典型的成纤维细胞样逐渐变为内皮细胞具有的上皮样细胞形态特点。从形态上验证了诱导后的细胞为内皮样细胞。

　　本实验建立了hADSCs内皮分化的最佳诱导体系，为血管组织工程学提供了稳定可靠的种子细胞来源。将为缺血性疾病的干细胞自体移植治疗，改善病人的生活质量，恢复家庭快乐生活带来新曙光。然而，诱导后的内皮细胞是否具有成熟内皮细胞的功能以及其分化调控机制，需进一步深入研究。

参考文献

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　　2 He HB，Shirota T，Yasui H，et al.Canine endothelial progenitor celllined hybrid vascular graft with nonthrombogenic potential〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg，2003;126(4):45564.

　　3 Neupane M，Chang CC，Kiupel M，et al.Isolation and characterization of canine adiposederived mesenchymal stem cells〔J〕.Tissue Eng Part A，2008;14(6):100715.

　　4 杨旭芳，何 旭，张丽红，等.高度同源性人脂肪干细胞体外分离培养条件的优化〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009;13(45)：88614.

　　5 He X，Li YL，Wang XR，et al.Mesenchymal stem cells transduced by PLEGFPN1 retroviral vector maintain their biological features and differentiation〔J〕.Chin Med J，2005;118(20):172834.

　　6 樊国华.干细胞移植干预下肢缺血性疾病〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007;11(50)：101546.

　　7 Chen J，Zhang ZG，Ly Y，et al.Intravenousadministration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats〔J〕.Circ Res，2003;92(6):6929.