细胞凋亡的信号转导机制研究进展

【关键词】 细胞凋亡；死亡受体；线粒体；内质网；粒酶B；Anoikis；胱天蛋白酶家族聚联反应

　　细胞凋亡是细胞在一定条件下接受刺激信号并受基因调控的一种自主性、程序性死亡过程。可以发生在生理和病理条件下。关于细胞凋亡的机制，在哺乳动物细胞中主要有以下几条通路：①死亡受体介导的细胞凋亡途径，②线粒体介导的凋亡途径，③内质网介导的细胞凋亡途径，④粒酶介导的细胞凋亡途径，⑤Anoiki介导的细胞凋亡途径。另外，这几条通路后期的共同途径是胱天蛋白酶家族激活。

　　1 凋亡受体介导的细胞凋亡途经
　　
　　细胞凋亡的死亡受体途径又被称为细胞凋亡的外部途径。死亡受体与相应配体相结合而被激活，经过下游系列信号级联反应，逐级激活起始胱天蛋白酶（如caspase8）〔1〕和效应胱天蛋白酶（caspase3，7等）〔2〕最终导致细胞发生凋亡。根据信号转导途径不同可分为以下三类。

　　1.1 受体Fas为代表介导的信号转导途径

　　该途径由死亡受体Fas为代表介导启动，死亡信号诱导复合体（deathinducing signal complex，DISC）的形成是级联反应的关键步骤〔3〕。Fas受体与Fas结合，受体发生多聚化，胞浆区的死亡域 (death domain，DD)也发生多聚化，使Fas活化。活化的Fas招募Fas相关死亡结构域蛋白（fasassociated death domain protein，FADD）。FADD一方面通过C端的DD结合Fas，另一方面通过其N端具有致凋亡能力的死亡效应结构域（death effector domain，DED）招募procaspase8，受体FADDprocaspase8在DISC局部的浓度增高，有助于caspase8发生同源活化。活化的caspase8可以剪切并活化caspase3、7、4、9和10〔4〕。活化的caspase3和7都可以剪切多聚聚合酶(ADP核酶)，引起DNA的降解使细胞凋亡。caspase10和9都已被证明可以在凋亡信号转导过程中先于其他蛋白酶活化，并通过其酶活性将信号传给其他caspase，最终导致了细胞凋亡的发生。这条通过DD和FADD的细胞凋亡调控途径是一条基本的凋亡途径。

　　1.2 肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis facter receptor Ⅰ，TNFRⅠ）为代表介导的信号转导途径

　　该途径由死亡受体TNFRⅠ为代表介导启动。肿瘤坏死因子受体(TNFRs) 是具有代表性的最大的死亡受体家族，主要包括TNFRⅠ(p55，CD120a)、TNFRⅡ (p75，CD120b)等。其共同特点是：胞内区都具有转导细胞死亡信号所必需的一段高度同源性的氨基酸序列，即DD。近年来，发现的死亡结构域蛋白主要包括FADD、TNFRⅠ相关死亡域结合蛋白（TNFR1associated death domain protein，TRADD）、相互作用受体蛋白(receptorinteracting protein，RIP)等。TNF主要是由感染而活化的巨噬细胞和T细胞产生，通过其细胞表面受体TNFRⅠ和TNFRⅡ介导细胞凋亡〔5〕。
　　
　　TNFRⅠ信号转导中最重要的分子是TRADD，它介导TNFRⅠ的凋亡信号，也介导了TNFRⅠ诱导转录核因子κB（NFκB）和活性蛋白 (activator protein1，AP1)活化的信号〔6〕。当配体TNF与TNFRs结合，TNFRⅠ三聚体化，并激活TNFRⅠ在质膜表面局部招募TRADD。TRADD可以引起两条信号转导通路的激活〔7〕：①通过招募FADD诱导细胞凋亡：TNFRⅠ胞浆区的死亡结构域与TRADD羧基端的死亡结构域结合，TRADD向TNFRⅠ胞浆区招募FADD，FADD再通过DED又进一步招募procaspase8；procaspase8发生同源活化，其下游caspase的级联反应导致细胞凋亡。②通过肿瘤坏死因子受体相关蛋白2(tumor necrosis factor receptorassociated factors 2，TRAF2)和RIP诱导转录因子活化：TRAF2和 RIP使NFκB诱导激酶（NFκBinducing kinase，NIK）活化。NIK使IκB发生磷酸化，并促进其分解和释放出NFκB， 使NFκB发生活化，并进入细胞核， 激活一系列基因表达，导致细胞凋亡发生。TRAF2和RIP还可以直接或间接地活化有丝分裂原/细胞外信号调节激酶激酶1(mitogenactivated protein kinase kinase kinase 1，MEKK1)或相关的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)，后者使cJun氨基末端激酶（cJun Ntenminal Kinase，JNK）和P38三肽区的苏氨酸/酪氨酸双磷酸化而激活JNK信号转导通路〔8〕，使细胞色素c（cytochrome c，cytc）释放，即通过线粒体介导通路，最终导致细胞凋亡。

　　1.3 TRAIL信号转导通路

　　目前已发现了两类TNF相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis induced ligand，TRAIL)受体〔9〕:一类为功能型受体，如TRAILR1和TRAILR2，因含有死亡结构域而分别被称为死亡受体4（death receptor 4，DR4）和死亡受体5（DR5）。DR3为一细胞因子受体，分布于富含淋巴细胞的组织和器官中，表现出诱导细胞凋亡和激活NFκB两种生物活性。另一类为无功能型受体，如 TRAILR3又称诱捕受体1（decoy receptor1，DcR1），TRAILR4又称诱捕受体2(decoy receptor1，DcR2)，所有受体的胞外区结构高度同源，无功能型受体胞内区缺失因而丧失介导细胞凋亡的功能。更重要的是，无功能型受体仅高表达于正常细胞，在癌细胞表面表达很低或不表达。
　　
　　TRAIL的生物学效应是通过与细胞膜上的相应受体结合而产生的〔10〕。TRAILR通过FADD〔11〕传递信号，可能的机制是被激活的 TRAILR 通过死亡结构域之间的相互识别作用与FADD结合，FADD再通过它的受体介导毒性结构域 (mediator of receptorinduced toxicity，MORT1)与MACH/FLICE(caspase8)〔12〕结合，从而激活 caspase8的白介素1b转化酶/美丽线虫死亡基因3(Interleukin1bconverting enzyme/Caenorhabditis elegans death，ICE/CED3)活性，后者再激活其他的ICE/CED3蛋白酶，启动caspase级联反应，作用于底物发生凋亡。

　　2 线粒体介导的细胞凋亡途径
　　
　　在脊椎动物细胞凋亡过程中，线粒体在细胞凋亡过程中起最基本的作用，其关键性分子是cytc〔13〕，而主要的信号转导通路是JNK信号转导通路。cytc是第一种被发现的线粒体释放促凋亡蛋白，是线粒体呼吸链的重要组成部分。正常情况下cytc是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白，稳定地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。在细胞凋亡过程中cytc的释放是线粒体外膜通透性增高的结果〔14〕。
　　
　　JNKP38和细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）的动态平衡决定了细胞的存活与凋亡〔15〕。前者主要促细胞凋亡，后者主要促细胞存活。细胞外刺激主要包括应激、紫外线、热休克、内毒素、TNF等作用于细胞，通过MAPKKK、有丝分裂素激活蛋白激酶激酶4(Mitogenactivated protein Kinase Kinase4，MKK4)和有丝分裂素激活蛋白激酶激酶7(Mitogenactivated protein Kinase Kinase7，MKK7)，使JNK和P38三肽区的苏氨酸/酪氨酸双磷酸化而激活JNK信号转导通路〔8〕，而后作用于线粒体，使线粒体释放cytc。cytc释放的具体机制有两种途径：①线粒体外膜蛋白聚合成膜通透转运孔（Permeability transition pore，PTP）复合体，是一种高电导非选择性通道〔16〕。外界刺激使PTP开放和线粒体膜电位崩解，水分进入导致线粒体外膜断裂cytc和凋亡介导因子(apoptotic inducing factor，AIF)释放。②Bcl2基因蛋白家族形成的通道〔17〕。Korneyer等证实正常情况下以单体形式存在于胞质的Bax在受到凋亡刺激时构相发生变化，导致Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜上，使线粒体外膜通透性增加，使游离的cytc释放至胞质〔18〕。进入胞质的cytc与凋亡酶激活因子1（apoptotic protease acticating factors1，APAF1）结合并将其激活，然后又结合辅助因子dATP/ATPAPA构成凋亡小体，其中的APAF1招募procaspase9在凋亡小体上寡聚，procaspase9发生同源活化〔19〕，其进一步激活下游的效应胱天蛋白酶caspase3，进而活化caspase6、7使细胞走向凋亡〔7〕。Ferri等〔20〕实验证明， 重组的AIF可以诱导细胞中染色质凝集和DNA大规模降解，而且可以诱导纯化的线粒体释放cytc和caspase9，从而诱发细胞凋亡〔11〕。在BAX/BAK缺如情况下，多肽氨基酸BH3结构域直接作用于线粒体使其释放cytc，从而介导细胞凋亡〔18〕。
　　
　　实验表明，Bcl2家族成员通过调节线粒体外膜的通透性和完整性起重要调控作用〔21〕，Bcl2家族可以分为两类：一类是抗细胞凋亡基因，其代表是Bcl2基因；另一类是促细胞凋亡基因，其代表是bax基因；他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用〔22〕。Bcl2/Bax 镶嵌在线粒体膜上，调控凋亡诱导蛋白的释放和线粒体功能。JNK可以通过Bim/Bmf 介导线粒体途径的凋亡，JNK可以通过AP1 提高两者的表达量，也可以直接磷酸化激活Bim/Bmf，再通过Bax/Bak来发挥作用〔23〕。此外，TNFα激活的JNK能够使Bid 转变成jBid，后者能促进线粒体释放Smac/Diablo到细胞浆内与IAP1结合，解除对caspase8的抑制作用。激活的caspase8一方面可以直接激活caspase3发挥促凋亡的作用；另一方面可以使Bid 转变成tBid，再次作用于线粒体释放cytc，通过caspase9/3发挥促凋亡作用〔24〕。研究发现，在野生小鼠胚胎成纤维细胞中（wildtype murine embryonic fibroblasts，WTMEFs)，白屈菜红碱也能诱导Bak活化和环孢素mPTP开放的敏感性使线粒体肿胀，10 h后cytc从线粒体释放〔25〕。Bcl2和BclXL直接与胞浆中的Apaf1相结合存在于线粒体外膜。通过线粒体Bcl2/BclXLApaflcaspase9前体四聚体复合物，对Apaf1的结构进行调控，从而抑制cytc的释放，Bcl2和BclXL就可以最终发挥抑制细胞凋亡作用〔26〕。

　　3 内质网介导细胞凋亡的途径
　　
　　钙离子在内质网介导细胞凋亡途径中起主要作用。研究证明〔27〕，Bcl2/Bak 位于内质网膜上。谷氨酸（Glu）是一种主要的兴奋性神经递质，它存在于各种中枢神经系统的神经突触。Glu从神经细胞释放并激活NR1A/NR2B NMDAR 和 mGluR5受体，可使Bcl2下调、内质网膜去极化及抑制超低分子肝素进入细胞，通过L，N和P/Q型钙离子门控通道N甲基D天门冬氨酸受体(NmethylDaspartate receotor，NMDAR)通道使钙离子释放，线粒体钙离子超载使PTP开放，cytc进入胞质，导致胱天蛋白酶级联反应最终导致细胞凋亡〔28〕。研究发现还有两种机制参与Glu诱导的细胞凋亡：胱天蛋白酶依赖途径和凋亡钙蛋白酶及凋亡诱导因子介导的胱天蛋白酶独立途径〔29〕。甲基苯丙胺可以使哺乳动物神经细胞中的Glu水平增加，激活NMDAR导致细胞内活性氮物质(reactive nitrogen species RNS)和ca2+增高，动力相关蛋白1 (dynaminrelated protein 1 Drp1)的多聚化和异位并进入线粒体使其破坏，cytc进入胞质，神经元细胞发生毒性反应〔30〕。
　　
　　此外，Bax抑制因子1 (Bax inhibitor1，BI1)，调节内质网介导的细胞凋亡通路和钙离子的释放。BI1的过度表达减少内质网钙离子进入细胞质，从而减少线粒体内钙离子聚集，抑制细胞凋亡。相反，细胞内BI1不足或缺乏，使Bax表达增强，启动内质网释放Ca2+，线粒体内Ca2+过度聚集使PTP开放，cytc释放，进入线粒体介导凋亡途径。

　　4 粒酶B（granzymes B，GrB）介导的细胞凋亡途径
　　
　　Gr是存在于细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic lymphocytes，CTL)和自然杀伤细胞（natural killer cell，NKC）的颗粒相关丝氨酸蛋白酶〔31〕。GrB是一种新型线粒体凋亡途径〔32〕。GrB 通过胞吞囊泡降解和膜孔释放入靶细胞胞质。髓细胞白血病1(Mcl1)的分裂与降解启动Gr介导的线粒体级联反应使线粒体释放细胞死亡介导因子（Bim）， Mcl1·Bim复合物被GrB降解后，启动Bim介导的细胞毒性机制〔33〕，最终导致细胞凋亡。

　　5 Anoika介导的细胞凋亡途径
　　
　　Anoikis是细胞凋亡途径的一种特殊类型，是由于细胞与细胞外基质(ECM)之间不适当或不充分的相互作用而引起的，其主要作用是维持高度更新的上皮组织。试验表明，死亡受体（DR5）参与了失巢凋亡外在途径的细胞凋亡。Anoikis通过外部途径死亡受体低聚化激活caspase8，引起caspase级联反应。Goldberg等〔34〕研究表明，在人类乳腺癌细胞Anoikis上调TRAIL的表达。TRAIL及其受体是介导Anoikis凋亡的启动者，因为在炎性蛋白101细胞悬浮培养24 h后，csrc、 Akt和FAK发生磷酸化使促凋亡基因（DR5、cJun、procaspase8和MCL1）表达增加、抑制凋亡基因（Bcl2、TRAF2、 RIP）表达下降及热休克蛋白p27、p70、 p90、XIAP表达未发生变化，导致下游因子如caspase8激活〔35〕。TNFR参与Anoikis介导的细胞凋亡途径，但是还没有数据证明DR5具体作用机制。

　　6 胱天蛋白酶的级联反应机制
　　
　　胱天蛋白酶是与细胞凋亡密切相关的蛋白酶家族。胱天蛋白酶的级联反应是经典凋亡通路后期的共同途径。caspase家族主要行使两种功能：诱导凋亡和参加炎症反应。现已明确caspase2、3、6、7、8、9、10参与细胞凋亡信号转导〔4〕。其中caspase8、9等是细胞凋亡的启动者，而caspase8是FAS和TNF受体家族凋亡信号转导的启动酶，caspase9是线粒体凋亡途径的启动酶。caspase3、6、7则是细胞凋亡的效应胱天蛋白酶，是细胞凋亡的执行者〔36〕。

　　7 抑制细胞凋亡在疾病防治中的可能性
　　
　　如上所述，cytc是线粒体介导凋亡途径的关键物质〔13〕，凋亡受体介导的细胞凋亡途经，是一条主要的细胞凋亡调控途径。此外，JNK信号转导通路的激活和Bcl2基因蛋白家族也在细胞凋亡过程中起着极其重要的作用。细胞凋亡从启动到执行经过一系列复杂的信号转导，涉及多种蛋白超家族，在任何环节上加以阻断均可达到抑制细胞凋亡的目的〔37〕。如抑制cytc的释放，或用某物质与cytc发生反应，使其失去激活下游caspase的功能；或可以增加Bcl2蛋白表达，减低细胞对凋亡信号的敏感性；或抑制胱天蛋白酶原的激活，从而抑制caspase的级联反应，达到抑制细胞凋亡的目的。

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