食管癌贲门癌患者T淋巴细胞、NK细胞免疫功能检测及意义

　　　　 作者：刘江惠 李建涛 贺宇彤 戴晓晖 郭建文 左连富

【摘要】 目的 本研究检测食管癌、贲门癌患者的免疫功能，寻找肿瘤患者的病情量化指标，用来预测和判定临床治疗效果。方法 采集本院胸外科手术前的食管癌贲门癌患者115例及359例正常体检者的血液标本，应用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8及NK细胞（CD56）的表达。结果 食管癌、贲门癌组与健康对照组相比较CD3、CD4有明显下降（P＜0.05），而CD8、CD56有明显的增高（P＜0.05）。将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴转移组，两组间CD3、CD4、CD8、CD56的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 食管癌外周血T细胞免疫检测有助于了解疾病的发展进程。

【关键词】 食管癌；贲门癌;T淋巴细胞亚群；NK细胞；CD3；CD4；CD8；CD56

　　现代肿瘤免疫学研究表明，肿瘤的发生和发展同机体免疫系统功能异常存在密切关系，而抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，其中胸腺依赖性淋巴细胞即T淋巴细胞又是细胞免疫系统的关键组成部分〔1〕。机体内的T淋巴细胞能识别肿瘤细胞，在接受肿瘤细胞刺激后，转化为能攻击和杀伤肿瘤细胞的致敏淋巴细胞，有着免疫监视机能。一旦这种监视机能遭到破坏，患肿瘤的危险就将增加。免疫功能正常与否，直接关系到肿瘤的发生、发展和预后。因此对于T淋巴细胞的研究越来越受到免疫学界和医学界的重视，成为近年来的研究重点。食管癌是目前我国发病率较高的恶性肿瘤之一，本研究就是通过对食管癌贲门癌患者外周血T淋巴细胞以及NK细胞相关指标的检测，来探讨食管癌贲门癌患者T淋巴细胞及NK细胞功能同食管癌贲门癌发生和发展的关系，以便临床上监测食管癌人群的免疫状态，对其免疫治疗具有重要的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　标本来自河北医科大学第四医院2006～2007年间搜集的115例食管癌患者，包含发生转移56例，未发生转移59例，患者平均年龄60岁，男87例，女28例。食管癌患者在采样前均未经手术、放疗、化疗等方法治疗。正常体检者血液标本359例作为正常对照组，其中男151例，女208例，平均年龄53岁。采集静脉血2 ml，EDTAK2抗凝。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞的免疫荧光标记

　　取抗凝全血0.1 ml，加入鼠抗人单克隆CD3FITC/CD56PE，CD4FITC/CD8PE；双标记抗体20 μl，（美国，BECKMAN COULTER公司生产，克隆系CD4：13B8.2，CD8:B9.11），室温孵育30 min。在免疫荧光制备仪上裂解红细胞后，流式细胞仪检测各亚群百分比。

　　1.2.2 流式细胞仪检测条件及参数

　　采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS11.5统计软件包，进行t检验、单因素方差分析。

　　2 结果
　　
　　免疫功能检测结果：经单因素方差分析发现4个指标（CD3、CD4、CD8、CD56）在癌症组与正常对照组间比较有统计学意义(P＜0.05)，见表1。将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组，经单因素方差分析发现4个指标（CD3、CD4、CD8、CD56）在两组间均没有差异(P＞0.05)，见表2。表1 癌症组与正常对照组免疫指标比较，表2 有无淋巴结转移组间免疫指标比较(略)

　　3 讨论
　　
　　恶性肿瘤作为一种免疫功能异常所导致的疾病得到了医学界的广泛共识，恶性肿瘤患者机体的免疫调节作用及其效应网络大多处于一种相对紊乱的状态，其中包括机体多种淋巴细胞、细胞因子、黏附因子及共同刺激因子等众多因素中单个因素或多个因素的失衡，而细胞免疫的紊乱在肿瘤免疫中具有主导作用，因此近年来对于T淋巴细胞和NK细胞等细胞免疫的主要效应细胞的研究已经成为现代肿瘤免疫学研究的重点。CD3是成熟T淋巴细胞的共同分化抗原，表达于所有成熟T淋巴细胞的表面，代表组织和血液中总的成熟T淋巴细胞〔2〕。陈罡〔3〕等的研究发现，在肝癌组织中，肿瘤细胞产生的肿瘤特异性抗原刺激肿瘤特异性T细胞在肿瘤组织中聚集、成熟，使得肝癌组织中的CD3+T细胞数量明显高于肝硬化组织及正常肝组织。冯伟华〔4〕等的研究显示，在实体肿瘤和非实体肿瘤中患者外周血CD3+CD56T细胞测定值在实体肿瘤组显著低于非实体肿瘤组和健康组，非实体肿瘤组和健康对照组间比较无显著性差异。由于本次实验的研究对象为食管癌贲门癌，也是实体肿瘤的一种，加之又都是应用流式细胞术检测外周血，所以本文中CD3+的表达情况同冯伟华等的报道相一致。基于以上文献的报道和本次试验的结果推测，食管癌贲门癌这类实体肿瘤患者的外周血CD3+T淋巴细胞数量较正常对照组显著降低可能是由于恶性肿瘤细胞所产生的肿瘤特异性抗原趋化CD3+T细胞向肿瘤组织中聚集并发育成为成熟的T淋巴细胞从而发挥其特有的抗肿瘤免疫的作用，因为这种聚集的作用，使得外周血中表达CD3的成熟T淋巴细胞的数量显著减少。
　　
　　CD56作为一种抗原标志，是220 kD糖蛋白，存在于外周血淋巴细胞及NK细胞表面，而不存在于中性粒细胞上，在人体内CD3-、CD16+、CD56+细胞的数量最多，约占外周血淋巴细胞总数的10%，表现出最强的NK细胞杀伤活性，CD3-、CD16-、CD56+细胞只占外周血淋巴细胞的5%以下，杀伤活性也较前一类细胞小〔5〕，本次试验的结果中显示，食管癌贲门癌组患者外周血CD56+细胞的数量显著多于正常对照组，将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组后比较，虽然两组间均值差异没有统计学意义，但是转移组较无转移组高的结果同孙文辉〔6〕等的研究报道相一致，这一现象的产生可能是随着肿瘤的进一步发展，刺激人体的免疫系统产生更多的NK细胞参与抗肿瘤免疫，但是，NK细胞的成熟需要IL2的刺激，而恶性肿瘤病人尤其是转移组mIL2R的结合表达率显著降低，与肿瘤患者体内存在封闭因子有关，随着病情的进展肿瘤本身产生的sIL2R可作为封闭因子与mIL2R竞争性结合周围的IL2，从而使与mIL2R结合的IL2减少，进而降低了IL2的生物学作用〔7〕。因此，不能发育成熟的NK细胞无法到达肿瘤组织中，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，而只能滞留在肿瘤患者的外周血中，造成食管癌贲门癌患者外周血表达CD56的细胞多于正常对照组。
　　
　　CD4+Th细胞是人体抗肿瘤免疫的重要组成部分，它所产生的IL2、IL4、IL5、INFγ是诸如NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等重要的免疫细胞活化所必需的，另外CD4+Th细胞本身还可以通过INFγ介导的机制直接杀伤肿瘤细胞〔8〕，从以上的论述可以看出CD4+Th细胞在抗肿瘤免疫中的核心地位，所以CD4+Th细胞数量的减少和活性的降低有可能是机体抗肿瘤免疫功能下降的根基。
　　
　　研究表明，T淋巴细胞活化需要2个信号，即T细胞活化不仅需要T细胞受体识别主要组织相容性复合物分子(第1信号)，还需要抗原递呈细胞(APC)表面的共刺激分子与其受体结合(第2信号)的共同作用，而CD28这个广泛表达于T淋巴细胞上的免疫蛋白超基因家族的成员正是扮演着这个第2信号的角色，CD8+T细胞根据CD28的表达与否分为细胞毒性T细胞(CD8+ CD28+)和抑制性T细胞(CD8+CD28-)，前者是重要的杀伤效应细胞而后者是不具有杀伤活性的免疫调节细胞。CD8+T细胞CD28表达受多种细胞因子调节，CD8+ CD28+T细胞的丢失和CD8+ CD28-T细胞积聚直接导致了CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞功能的下降，因而是T细胞功能下降的标志〔9，10〕，这一观点得到了临床研究的证实〔11〕。

参考文献

　　1 吉春宇，杨 异，赵 珩，等.手术对肺癌患者外周血T细胞亚群的影响〔J〕.上海医学，2004；27(10)：367.

　　2 曹志新，陈孝平，吴在德.肝癌合并肝硬化患者脾脏T细胞亚群免疫状态的研究〔J〕.中国普通外科杂志，2002；11(6):3613.

　　3 陈 罡，罗殿中，李 萍，等.原发性肝细胞癌、癌旁及肝硬化组织中CD3+细胞的研究〔J〕.中国普通外科杂志，2005；14(2)：341.

　　4 冯伟华，王兰兰，武永康，等.外周血CD3+CD56+T 细胞在恶性肿瘤患者中的表现及临床意义〔J〕.免疫学杂志，2001；17(1)：74.
　
　　5 林飞卿，余传霖，何球藻.医学基础免疫学〔M〕.上海：上海医科大学出版社，1992;75.

　　6 孙文辉，吴昌平，张红宇，等.测定CD56在恶性肿瘤中的临床研究〔J〕.中国肿瘤临床与康复，1999；6(1)：13.

　　7 孙文辉，邱国强，吴浩清，等.CD25在监测恶性肿瘤中的临床研究.中国肿瘤临床与康复，1998；(1):18.
　
　　8 曾瑞红，房桂珍，魏 林，等.CD4+ T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用〔J〕.细胞生物学杂志，2008；30:304.

　　9 Martinez Escribano JA，Hemadez Caselles T.Changes in the number of CD8+，CD86+ and CD28+ peripheral blood lymphocytes have prognostic value in melanoma patients〔J〕.Hum Immunol，2003；64 (8):79680.

　　10 Tsukishino T，Donnenbrerg AD，Whiteside TL.Rapid tumover of the CD8(+)CD28()Tcell subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2003；52(10):599607.

　　11 金秀国，刘晓光，刘 波.胃癌患者外周血淋巴细胞CD8、CD28表达的检测及临床意义〔J〕.江西医学检验杂志，2007；25(1):17.