CD14的基因型及血清水平与急性心肌梗死的关系

　　　　作者：刘忠仁 刘运广 韦叶生 潘兴寿 黄照河 蒙兰青

【摘要】 目的 研究CD14基因启动子159C/T、260C/T多态性各等位基因及基因型在急性心肌梗死（AMI）患者中的分布频率，初步分析其基因型及血清水平与AMI的相关性。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，检测120例AMI患者及130例正常对照组CD14的基因多态性，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CD14水平。结果 AMI组血清CD14水平显著高于对照组(P<0.01)，CD14基因159C/T多态性在AMI组和正常人群中的分布差异无显著性（P>0.05），而CD14基因260C/T多态性在两组人群中的分布差异存在显著性（P<0.05），等位基因频率的相对风险分析发现，T等位基因携带者患AMI的风险是C等位基因的1.654倍(OR=1.654，95%CI：1.161～2.356)，携带T等位基因的AMI患者血清CD14水平显著高于不携带者(P<0.05)。结论 CD14基因启动子260C/T多态性与AMI的发病具有相关性，其中T等位基因可能是AMI发病的遗传易感基因；携带T等位基因的个体可能通过促进CD14的高度表达进而增加了AMI的发病风险。

【关键词】 急性心肌梗死；CD14；基因多态性

　　CD14是新近几年倍受关注的一种多功能炎症细胞因子，在炎症、免疫反应及动脉粥样硬化形成中起着重要作用，并且与心血管疾病存在着密切关系〔1〕。然而，目前CD14在急性心肌梗死(AMI)中异常表达的分子遗传学机制尚不清楚。为此，本文采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）和酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法，研究CD14基因多态性及血清水平与AMI的关系，阐明其基因型与表型之间的联系，探讨AMI分子遗传学机制。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　根据1979年WHO对AMI的诊断标准，临床确诊的AMI组患者120例，男87例，女33例，年龄52～85〔平均（62.7±10.9）〕岁。健康对照组130例选自门诊健康人群的随机个体，男90例，女40例，年龄51～82〔平均（61.8±11.8）〕岁，血常规、血脂及其他生化指标均在参考范围内，心电图检查正常，均排除肝脏、肾脏、内分泌和脑血管等疾病。研究对象均为广西地区非血缘个体。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA提取

　　AMI于发作当时采血2 ml；对照组标本在清晨空腹采静脉血2 ml，用EDTAK2抗凝；采用已建立的改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-70℃保存备用。

　　1.2.2 PCR扩增

　　参照文献〔2，3〕设计两对引物，由北京赛百盛有限公司合成。用于特异性扩增CD14基因包含159位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′GTGCCAACAGATGAG GTTCAC3′；下游引物为：5′GCCTCTGACAGTTTATGTAATC3′；扩增CD14基因包含260位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′TGGCCTAAGGCACTGAGGAT CAT3′；下游引物为：5′TCAGTTCCCTCCTCTGTGAACCC3′。CD14的PCR扩增反应体系均为50 μl，其中含10×PCR 缓冲液5.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μl，上、下游引物各40 pmol，模板DNA10.0 μl，TaqDNA聚合酶2.5 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至50 μl。置热循环仪(TC48/H型)中94℃预变性3 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性45 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循环后，72℃延伸5 min。

　　1.2.3 扩增产物的限制性酶切

　　分别取PCR扩增产物10 μl，用5 U限制性内切酶Ava Ⅱ酶切CD14基因159位点，37℃孵育2 h；用5 U限制性内切酶Hae Ⅲ酶切CD14基因260位点，37℃孵育3 h，反应终止后，消化片段在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，苏木素尹红（EB）染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照。

　　1.2.4 血清CD14水平的检测

　　采用ELISA测定可溶性CD14(sCD14)的血清水平，每次测定均严格按说明书操作。

　　1.2.5 血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平测定

　　酶法测定血清总胆固醇（TC）和甘油三酯(TG)；遮蔽法直接测定高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)；载脂蛋白（apo）A，apoB用双波长免疫透射比浊法测定。以上测定均在7060型(日本)全自动生化分析仪上进行，每次测定均选用高、中、低3种质控样品进行质控，以上项目检测质控均符合英国RIQAS国际质控标准。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS10.0软件包进行分析。计量资料用x±s表示，组间比较用t检验、方差分析。计数资料比较采用χ2检验，并以比值比（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对风险度。

　　2 结果

　　2.1 CD14基因型分析

　　CD14基因159C/T多态性，PCR扩增产物片段大小为497 bp，根据限制性内切酶Ava Ⅱ酶切片段的情况，基因型有3种，CC型（497 bp 1条带），CT型（497，353，144 bp 3条带），TT型（353，144 bp 2条带）；CD14 基因260C/T多态性，PCR扩增产物片段大小为268 bp，根据限制性内切酶Hae Ⅲ酶切片段的情况，基因型有3种，CC型（159，109 bp 2条带），CT型（268，159，109 bp 3条带），TT型（268 bp 1条带），见图1，图2。

　　2.2 两组临床资料比较

　　AMI组TC、TG、LDLC和sCD14水平均显著高于对照组（P<0.05）；收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、HDLC、apoA、apoB在两组间比较差异无显著性（P>0.05），见表1。表1 AMI组与对照组临床资料比较（略）

　　2.3 AMI组与对照组CD14基因多态性的比较

　　CD14基因启动子260位点基因型在两组人群中的分布差异有显著性（χ2=7.385，P<0.05）；等位基因频率在两组人群中的分布也存在着显著性差异（χ2=7.803，P<0.05）；等位基因频率的相对风险分析发现，T等位基因携带者患AMI的风险是C等位基因的1.654倍（OR=1.654，95%CI：1.161～2.356）；CD14基因159C/T多态性在两组人群中的分布差异无显著性（P>0.05），见表2。表2 AMI组与对照组CD14基因多态性分布（略）

　　2.4 AMI组中各基因型间CD14血清水平的比较 在AMI组中，CD14基因159位点各基因型间sCD14血清水平〔分别为(13.03±5.4)、(13.21±4.81)、(13.53±5.72) μg/ml〕的比较差异均无显著性（P>0.05）；而CD14基因260位点各基因型间（CC、CT和TT基因型）sCD14血清水平两两比较，发现CT基因型携带者的CD14血清水平显著高于CC基因型〔（8.03±4.37）μg/ml比（6.95±3.81）μg/ml，P<0.05〕，TT基因型携带者的CD14血清水平〔(8.46±4.38)μg/ml〕也显著高于CC基因型（P<0.01），而CT基因型携带者的CD14血清水平与TT基因型比较差异无显著性（P>0.05）。

　　3 讨论

　　CD14为革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(LPS)的受体，属细胞表面糖蛋白家族成员之一，主要由成熟的单核巨噬细胞所产生，CD14的主要功能是在LPS结合蛋白的协助下结合LPS并引起细胞活化，从而引起致炎因子的释放和促凝因子的合成，从而加速或促进动脉粥样硬化的形成〔1〕。CD14与LPS的结合参与动脉粥样硬化的形成主要有以下3个方面的机制：一是刺激单核巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素（IL）1、IL6、血小板衍生的生长因子及活性氧等物质，这些物质可能引起细胞的迁移和血管平滑肌细胞的增殖并能加重炎症反应；二是诱导内皮细胞产生大量的黏附分子，促进细胞的黏附；三是诱导巨噬细胞和内皮细胞释放具有促凝活性的组织因子、蛋白酶等，促进血栓的形成。因此，CD14的表达与动脉粥样硬化之间存在着密切联系。CD14基因位于第5号染色体5q2331区，在基因启动子区域上游159位点和260位点（转录起始位点上游159和260 bp）均存在C/T多态性，这两种基因多态性的存在可能影响CD14基因转录和表达〔4〕，进而影响到CD14的生物学功能，从而影响CD14相关疾病的发生、发展和转归。
　　
　　关于CD14基因多态性与AMI的关系，目前文献报道尚不多，且研究的结果不尽相同〔5，6〕。由于基因多态性存在种族间的差异，CD14基因多态性与AMI之间是否存在相关性，是否通过影响CD14的表达而影响AMI的病程等，目前尚无定论。本文结果提示T等位基因可能是AMI的危险因素之一。并且我们推测在病理条件下，携带T等位基因的个体可促进CD14的高度表达进而增加AMI的发病风险。CD14基因启动子159C/T多态性与AMI的发病无相关性，对sCD14血清水平也无影响，认为这种基因多态性可能在AMI的发生、发展过程中不起直接的重要作用。
　　
　　综上所述，AMI是一种多因素参与的常见病，遗传因素在其中起着重要作用，本研究结果提示，CD14基因启动子260C/T多态性与AMI具有一定相关性，其中T等位基因可能是AMI的遗传易感基因，携带T等位基因的个体可促进CD14的高度表达而增加AMI的发病风险。但CD14基因多态性在AMI发病中的确切机制尚不清楚，有待进一步研究和探讨。

参考文献

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